-1-

ĆWICZENIE 4 czwartek/piątek

1. Dezynfekcja rąk mieszaniną Visirub i Sterillium i kontrola dezynfekcji pod lampą

2. Oznaczanie aktywności przeciwdrobnoustrojowej preparatu dezynfekcyjnego STERINOL metodami rozcieńczenia = neutralizacji oraz sączenia przez filtr membranowy:

1. Walidacja metod:

• walidacja wybranych warunków badania,

• walidacja toksyczności neutralizatora,

• walidacja metody rozcieńczania - neutralizacji

• walidacja procedury sączenia

UWAGA 1.

Każda grupa wykonuje oznaczenia aktywności przeciwdrobnoustrojowej preparatu Sterinol zgodnie z normą w trzech różnych stężeniach (jedno stężenie w zakresie aktywnym i jedno w zakresie nieaktywnym).

Trzy odpowiednio rozcieńczone preparaty STERINOL znajdują się w każdej grupie asystenckiej.

UWAGA 2.

- do oznaczeń właściwych należy używać zawiesiny zawierającej od 1.5x10⁸ do 5.0x10⁸ cfu/ml

- do oznaczeń walidacyjnych należy używać zawiesiny zawierającej od 6 x 10² do 3 x 10³ cfu/

Dlatego przed rozpoczęciem oznaczeń należy sporządzić odpowiednie zawiesiny szczepu testowego (każda grupa używa innego szczepu testowego, który należy przygotować wg indywidualnej instrukcji). Aby „policzyć” drobnoustroje w przygotowanej zawiesinie należy:

1. do 6 probówek wlać po 4.5ml soli fizjologicznej,

2. do pierwszej probówki dodać 0.5 ml szczepu testowego, a następnie wykonać seryjne 10- krotne rozcieńczenia przenosząc po 0.5ml mieszaniny do następnej probówki.

3. z 5 i 6 probówki pobrać po 1.0 ml mieszaniny i przenieść do pustych jałowych płytek, które następnie trzeba zalać podłożem TSA-agar (wykonujemy to w powtórzeniu; potrzebne 4 płytki)

4. po inkubacji należy policzyć wyrosłe kolonie (znajomość liczby drobnoustrojów w zawiesinie jest niezbędna do obliczenia stopnia redukcji liczby drobnoustrojów testowych przez środek dezynfekcyjny - STERINOL)

-2-

Badania walidacyjne mają na celu sprawdzenie czy warunki badania nie mają negatywnego wpływu na prawidłowość uzyskiwanych wyników.

Walidacja metody rozcieńczania-neutralizowania

1. Walidacja wybranych warunków badania

1.Umieścić w probówce 1 ml płynu rozcieńczającego Trypton-NaCl oraz 1 ml zawiesiny drobnoustroju testowego zawierającej

od 6 x 10² do 3 x 10³ cfu/ml,

2. Zawartość probówki zamieszać, dodać 8,0 ml twardej wody i znowu zamieszać,

3. Przed upływem 5 min pobrać dwie próbki po 1.0 ml mieszaniny i przenieść do dwóch oddzielnych płytek Petriego.

4. Dodać upłynnionego podłoża TSA - AGAR inkubować w 36-37^o C, obliczyć liczbę cfu/ml w walidacji warunków badania (wartość A).

2. walidacja toksyczności neutralizatora (czyli sprawdzenie, czy sam neutralizator nie ma negatywnego wpływu na przeżywalność drobnoustrojów testowych):

1. Umieścić w probówce 8.0 ml neutralizatora i 1.0 ml wody twardej.

2. Dodać 1.0 ml zawiesiny szczepu testowego zawierającej od 6x10² do 3x10³ cfu/m zamieszać, pozostawić przez 5 min,

3. Zawartość probówki znowu zamieszać, a następnie pobrać dwie próbki po 1.0 ml, które należy przenieść do dwóch oddzielnych płytek Petriego.

4.Dodać upłynnionego podłoża TSA-AGAR, inkubować w 36-37^o C, obliczyć liczbę cfu/ml w warunkach walidacji toksyczności neutralizatora (wartość B).

UWAGA!!! UPŁYNNIONE PODŁOŻE TSA - AGAR ZNAJDUJE SIĘ W ŁAŹNI WODNEJ

-3-

Walidacja metody rozcieńczania - neutralizacji.

1. Dodać do probówki 2 ml rozcieńczalnika - trypton-NaCl, a następnie 8.0 ml badanego produktu w najwyższym stężeniu jakie jest badane,

2. Zawartość probówki zamieszać, przenieść 1 ml do 8 ml neutralizatora, pozostawić przez 5 min. (czas niezbędny dla neutralizacji),

3. Dodać 1 ml. zawiesiny bakteryjnej zawierającej

od 6 x 10² do 3 x 10³ cfu/ml, popatrzeć na zegarek i pozostawić w temp. 20^o C przez 30 min.

4. Pobrać dwie próbki po 1.0 ml, przenieść do oddzielnych płytek Petriego.

5. Dodać upłynnionego podłoża TSA-AGAR, inkubować

w 36-37^o C, obliczyć liczbę cfu/ml dla walidacji metody rozcieńczania - neutralizacji (wartość C).

Walidacja metody sączenia przez filtr membranowe

- walidacja procedury sączenia.

1.Pobrać dwie próbki po 0,1 ml mieszaniny zawierającej

od 6x10²do 3,0x10³ cfu/ml i przenieść do dwóch oddzielnych kolbek zawierających po ok. 50 ml płynu płuczącego,

2. Próbki przesączyć przez filtr membranowy, przepłukać ok. 50 ml płynu płuczącego.

3. Filtry przenieść na 2 płytki z podłożem TSA-AGAR,

4. Po inkubacji należy policzyć kolonie wyrosłe na filtrze.

Uwaga! Filtr należy ułożyć stroną sączoną do góry w taki sposób, aby powietrze nie dostało się między filtr a powierzchnię agaru.

-4-

Badanie metodą rozcieńczania-neutralizowania - wykonuje się oddzielnie dla trzech stężeń preparatu STERINOL

w trzech oddzielnych, odpowiednio podpisanych probówkach

Do probówek należy dodawać kolejno:

1/. 1.0 ml rozcieńczalnika Trypton-NaCl,

2/. 1.0 ml zawiesiny bakterii testowych zawierającej

od 1.5x10⁸ do 5.0x10⁸ cfu/ml.,

3/. 8.0 ml badanego rozcieńczonego Sterinolu,

4/. zawartość probówek zamieszać i po upływie 1min kontaktu bakterii z preparatem,

5/. pobrać 1.0 ml mieszaniny i przenieść do probówki zawierającej 8.0 ml neutralizatora i 1.0 ml wody twardej, pozostawić w celu neutralizacji na 5 minut na stole laboratoryjnym,

6/. pobrać próbkę 1.0 ml, przenieść do płytki Petriego i zalać podłożem TSA-AGAR.

Badanie metodą sączenia przez filtry membranowe preparatu STERINOL w różnych stężeniach:

Do probówki dodawać kolejno:

1/ 1.0 ml rozcieńczalnika Trypton-NaCl,

2/ 1.0 ml zawiesiny bakteryjnej zawierającej od 1.5x10⁸ do

5.0x10⁸ cfu/ml.,

3/ 8.0 ml badanego rozcieńczonego Sterinolu, zawartość

probówki natychmiast zamieszać,

4/ po upływie 1 min kontaktu bakterii ze środkiem

dezynfekcyjnym pobrać 0.1 ml mieszaniny do kolbki

zawierającej 50 ml płynu płuczącego (poprzez rozcieńczenie

następuje przerwanie działania Sterinolu),

5/ zawartość kolbki natychmiast przesączyć przez filtr

membranowy,

6/ następnie filtr przepłukać co najmniej 150 ml płynu

płuczącego (nie więcej niż 500 ml), a następnie przenieść na

płytkę z agarem TSA. Po inkubacji liczy się kolonie wyrosłe na

filtrze.

Dezynfekcja rąk - Dostają Państwo do dyspozycji w butelkach z dozownikami mieszaninę Visirub i Sterillium. W mieszaninie oprócz środków dezynfekcyjnych i glikolu propylenowego znajduje się dietyloaminometylokumaryna, która pod lampą daje białą fluorescencję.

Dłonie należy dezynfekować w sposób jaki pokazano na rysunkach. Proces dezynfekcji rąk jest podzielony na 6 „kroków”; każdy „krok” należy powtórzyć 5x. Następnie ręce należy obejrzeć pod lampą.

Po przeprowadzeniu prawidłowej dezynfekcji, całe dłonie powinny świecić; miejsca nie świecące pokazują gdzie preparat nie dotarł (przeważnie skórki przypaznokciowe, miejsca między palcami, prawy kciuk, nadgarstki).

Dobrym przykładem jest zdezynfekowanie rąk np. z pierścionkiem. Po jego zdjęciu i włożeniu rąk pod lampę mamy dobrze widoczne miejsca nie świecące w postaci nie świecącej obrączki na skórze.

Po całym doświadczeniu ręce należy umyć zwykłym mydłem.

Ćwiczenie 5 wt/środa 28/29/04/09r

1. Określenie aktywności bakteriobójczej preparatów przeznaczonych do higienicznej dezynfekcji rąk metodą wcierania

Celem próby jest ustalenie czy produkt przeznaczony do higienicznej dezynfekcji rąk metodą wcierania zmniejsza uwalnianie przejściowej flory zgodnie z wymaganiami, wówczas gdy środek ten jest wcierany w sztucznie zanieczyszczone ręce ochotników. Normę tę stosuje się, gdy dezynfekcja wskazana jest ze względów medycznych.

Wymagania

Średnia wartość redukcji liczby drobnoustrojów testowych ze sztucznie skażonych dłoni nie powinna być statystycznie znacząco mniejsza niż ta uzyskiwana w wyniku wzorcowej dezynfekcji za pomocą 60% 2-propanolu.

ZASADA METODY

Liczba drobnoustrojów testowych uwalnianych z opuszek palców sztucznie zanieczyszczonych rąk jest oceniana przed i po higienicznej dezynfekcji rąk metodą wcierania. Stosunek dwóch uzyskanych wartości jest nazywany współczynnikiem redukcji.

Wykonanie badania.

1. Umyć ręce łagodnym mydłem w celu usunięcia naturalnej flory przejściowej, wysuszyć ręce za pomocą ręczników papierowych. Zanurzyć na 5 sekund obie ręce do połowy śródręcza (palce rozstawione) w 18-24 godz. hodowli bulionowej Escherichia coli ATCC 10538. Trzymać ręce w pozycji poziomej przez 3 min, powoli obracać nimi aż do obeschnięcia.

Szczep jest absolutnie bezpieczny, przeznaczony specjalnie do badań dezynfekcji rąk.

2. Pocierać opuszkami palców o dno płytki Petriego zawierającej 10 ml bulionu TSB bez neutralizatora (do każdej ręki stosować oddzielną płytkę).

3. Z bulionów TSB przygotować w soli fizjologicznej rozcieńczenia 10^-2 i 10^-4.

Z każdego rozcieńczenia nanieść po 0.1ml bulionu na powierzchnię płytki z podłożem TSA- Agar, rozprowadzić głaszczką wypaloną w spirytusie po powierzchni płytki, inkubować, policzyć wyrosłe drobnoustroje.

W ten sposób ocenia się wartość początkową czyli uwalnianie drobnoustrojów testowych przed zastosowaniem procedury dezynfekcji.

Uwaga! Dezynfekcję rąk produktem wzorcowym lub badanym wykonują osoby po skażeniu rąk szczepem testowym

4. Dezynfekcja rąk wzorcowym produktem :nalać 3 ml 60% 2-propanolu na suche dłonie ułożone w kształt kubka i wcierać mocno w skórę przez 30 sek. Procedura obejmuje na każdym etapie pięciokrotne pocieranie dłoni (patrz rysunek). Procedurę należy powtórzyć z następnymi 3ml propanolu tak, aby całkowity czas wcierania wynosił 60 sek, a następnie przez 5 s należy płukać palce w bieżącej wodzie wodociągowej.

-2-

5. Dezynfekcja rąk badanym produktem STERINOL: procedura powinna być realizowana zgodnie z informacją dostarczoną przez wytwórcę. Całkowity czas wcierania powinien być ograniczony do 30s lub 60s. Procedura kończy się 5sek płukaniem palców w bieżącej wodzie i strząśnięcie jej nadmiaru.

6. Natychmiast należy pocierać przez 1 min opuszkami palców jednej ręki o dno płytki Petriego zawierającej 10 ml bulionu TSB z dodatkiem neutralizatora

7. Z bulionów TSB przygotować rozcieńczenia 10^-1. Na płytki z TSA posiać bulion nie rozcieńczony i rozcieńczony 10^{-1 ,} rozetrzeć głaszczką, inkubować, policzyć wyrosłe kolonie.

W ten sposób ocenia się wartość końcową w próbie czyli uwalnienie drobnoustrojów testowych po zastosowaniu procedury dezynfekcji (preparatem badanym lub wzorcowym).

8. Następnie należy określić liczbę bakterii przed i po procesie dezynfekcji, porównać wyniki z kolegami z innych grup, zwłaszcza z osobami używającymi do dezynfekcji wzorcowego propanolu.

Uwaga. Badanie wg normy powinno być prowadzone z udziałem 12-15 osób, których skóra jest zdrowa, bez skaleczeń lub otarć. W doświadczeniach nie powinno się korzystać z oferty osób posiadających zgrubiałą i zniszczoną skórę.

2. Oznaczanie poziomu penicyliny G w surowicy krwi przy użyciu techniki

seryjnych rozcieńczeń /MIC/.

Na stołach znajdują się:

• probówka z penicyliną o stężeniu 1j/ml,

• 2 probówki zawierające surowice o nieznanej zawartości penicyliny podpisane - surowica badana x, surowica badana y

• 18-godz. hodowla szczepu testowego S.aureus ATCC 6538.

Wykonanie oznaczenia:

1. Do 3 rzędów wstawić po 6 probówek, rozlać po 1 ml bulionu

2. Do pierwszej probówki pierwszego rzędu dodać 1ml wzorcowego roztworu

penicyliny (1 jednostka/ml), wymieszać, przenieść 1ml do następnej probówki.

W ten sposób wykonać seryjne rozcieńczenia od 1/2 do 1/64.

3. Do pierwszej probówki drugiego i trzeciego rzędu dodać po 1ml badanej surowicy, następnie wykonać seryjne dwukrotne rozcieńczenia ( jak wyżej)

4. Do wszystkich probówek dodać po 1 kropli 18-godzinnej hodowli S.aureus ATCC 6538 rozcieńczonej 100x w soli fizjologicznej

5. Inkubację probówek prowadzić przez 18 godz. w temperaturze 37^oC.

-3-

3. Wykonanie oznaczenia aktywności kolistyny - metoda dyfuzyjna z

zastosowaniem krzywej wzorcowej. Na stole laboratoryjnym znajdują się:

• szczep testowy Bordetella bronchiseptica,

• przyrząd do robienia dziurek w agarze,

• 2 duże, puste, wysterylizowane płytki,

• roztwory kolistyny o znanych stężeniach,

• roztwory kolistyny o nieznanym stężeniu podpisane Kol A i Kol B,

Szczepem testowym używanym w oznaczeniu kolistyny jest Bordetella bronchiseptica ATCC 4617. Oznaczenie to można wykonywać metodą z użyciem stalowych cylinderków lub z wykorzystaniem otworów o średnicy 10 mm wycinanych w agarze.

Dla wyznaczenia krzywej wzorcowej przygotowuje się w buforze fosforanowym o pH 6,0 sześć roztworów wzorca o następujących stężeniach:

10.0; 9.0; 7.0; 5,0, 3,0, 1,0 ၭg/cm³. Próbki wzorca oraz próbki badane Kol A i Kol B są już przygotowane i znajdują się w probówkach typu Ependorf.

Należy :

1. Przygotować 2 płytki z podłożem zakażonym bakteriami testowymi- (szczep znajduje się na każdym stole laboratoryjnym).

Wykonujemy to w następujący sposób:

a/ Podłoże AM10 w ilości wystarczającej na dwie duże płytki znajduje się w łaźni wodnej; należy je wystudzić (nie pod zimną wodą- bo się robią skrzepy) i bardzo delikatnie( aby nie powstały pęcherzyki powietrza) wymieszać z 2 ml szczepu wzorcowego Bordetella bronchiseptica

b/ Płytki należy wylać na wypoziomowanym stole w pokoju obok sali ćwiczeń i nie opalać jej powierzchni nawet gdy utworzą się pęcherzyki powietrza (aby nie zabić drobnoustroju testowego),

c/ Po zastygnięciu podłoża płytki należy przenieść na ok. 30 min. do lodówki a następnie wyborować 6 dziurek zanurzoną w alkoholu i opaloną w płomieniu palnika opiłowaną pipetą - agar z wnętrza dziurek wyjmujemy do płytki Petriego za pomocą wykonanego z ezy haka - (płytka na odpady z materiałem zakaźnym znajduje się na każdym stole),

2. Do dziurek wkroplić po 100ၭl = 0.1 ml roztworów prób wzorcowych (standard kolistyny) oraz próby badane

3. Płytki pozostawić w temperaturze pokojowej na 0,5 godziny, a potem inkubować w temperaturze 35⁰C przez 16-18 godz.

4. Po zakończeniu inkubacji, zmierzyć strefy zahamowania wzrostu szczepu testowego wokół otworów i wykreślić krzywą wzorcową, z której następnie odczytuje się zawartość kolistyny w próbach badanych.

UWAGA. Grupa asystencka wykonuje to doświadczenie w dwóch powtórzeniach. W każdej płytce robi się 7 dziurek; do 6 wkrapla się kolistynę w znanych stężeniach do siódmej próbki badane podpisane Kol A - 1 płytka lub Kol B - druga płytka.

Ćwiczenie 3 - Odczyt wyników z poprzedniego ćwiczenia:

1. Ocena aktywności bakteriobójczej preparatów przeznaczonych do higienicznej dezynfekcji rąk; policzyć kolonie wyrosłe na płytkach, aby oznaczyć:

a/ wartość początkową czyli uwalnianie drobnoustrojów testowych przed zastosowaniem procedury dezynfekcji.

b/ liczbę uwalnianych drobnoustrojów testowych po zastosowaniu procedury dezynfekcji wzorcowym środkiem dezynfekcyjnym,

c/ liczbę uwalnianych drobnoustrojów testowych po zastosowaniu procedury dezynfekcji badanym środkiem dezynfekcyjnym

d/ zapisać i porównać wyniki, obliczyć współczynnik redukcji.

2. Badanie preparatu dezynfekcyjnego STERINOL dwoma metodami: rozcieńczania - neutralizacji i sączenia przez filtry membranowe.

a/ policzyć kolonie na płytkach, zapisać wyniki a następnie obliczyć stopień redukcji bakterii testowych i ocenić czy preparat spełnia zalecenia normy.

3. Oznaczanie poziomu penicyliny w surowicy krwi

techniką seryjnych rozcieńczeń,

ODCZYT: Ustalić, w jakich rozcieńczeniach wzorcowa i badana próbka surowicy hamują wzrost testowego szczepu S.aureus 209P

Obliczyć stężenie penicyliny w badanej surowicy na podstawie wzoru:

A

D = --- Ⴔ C gdzie:

B

D - stężenie penicyliny w surowicy krwi badanej,

A - odwrotność rozcieńczenia surowicy badanej hamującego

wzrost gronkowca,

B - odwrotność rozcieńczenia surowicy wzorcowej hamującego

wzrost gronkowca,

C - stężenie penicyliny w surowicy wzorcowej (1 j/ml)

Przykład: rozcieńczenie surowicy badanej hamujące wzrost gronkowca wynosi 1/64, rozcieńczenie surowicy wzorcowej 1/32, stężenie penicyliny w surowicy badanej 1j /ml:

64

D = ----- Ⴔ 1 = 2 j /ml

32

Oznaczenia aktywności kolistyny metodą dyfuzyjną z zastosowaniem krzywej wzorcowej.

Odczyt: po zakończeniu inkubacji, zmierzyć przy użyciu papieru milimetrowego strefy zahamowania wzrostu szczepu testowego wokół otworów i wykreślić krzywą wzorcową, (na papierze milimetrowym) Z krzywej wzorcowej odczytuje się zawartość kolistyny w próbach badanych.

Instrukcja dla grupy pracującej z

Pseudomonas aeruginosa

OD zawiesiny mierzonej na densytometrze

powinna wynosić 0.7

Rozcieńczenia STERINOLU: 75x; 150x i 300x

Instrukcja dla grupy pracującej z

Escherichia coli

OD zawiesiny mierzonej na densytometrze

powinna wynosić 0.7

Rozcieńczenia STERINOLU: 75x; 150x i 300x

Instrukcja dla grupy pracującej z

Staphylococcus aureus

OD zawiesiny mierzonej na densytometrze

powinna wynosić 0.8

Rozcieńczenia STERINOLU: 250x; 500x; 750x

Instrukcja dla grupy pracującej z

Enterococcus hirae

OD zawiesiny mierzonej na densytometrze

powinna wynosić 0.8

Rozcieńczenia STERINOLU: 250x; 500x; 750x

---