Państwowa Wyższa Szkoła

Informatyki i Przedsiębiorczości w Łomży

^{.....................................................................................................................................}

Instytut Technologii Żywności

Instrukcja do zajęć laboratoryjnych

Temat ćwiczenia:

Witaminy

Izolowanie i ilościowe oznaczanie kwasu askorbinowego (witaminy C).

Numer ćwiczenia: 7

Laboratorium z przedmiotu:

BIOCHEMIA

Wstęp

Rola witamin została odkryta stosunkowo niedawno. Dopiero na początku XX wieku zauważono, że dla zapewnienia prawidłowego przebiegu procesów życiowych, oprócz składników budulcowych i tych będących źródłem energii, potrzebne są "dodatkowe czynniki pokarmowe". W roku 1912 polski biochemik Kazimierz Funk wydzielił taki właśnie składnik pokarmowy przeciwdziałający chorobie beri-beri, nazywając tę substancję "witaminą".

Obecnie doskonale wiadomo, że witaminy są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania organizmu, wspomagają wzrost i w konsekwencji odpowiednich zdrowie i życie organizmów zwierzęcych. To podstawowe, niekaloryczne substancje odżywcze, które w odróżnieniu od składników mineralnych pochodzących z gleby, są produkowane przez organizmy żywe - rośliny i zwierzęta. Wspólną ich cechą jest niewielki ciężar cząsteczkowy, który ułatwia im działanie. Warto również podkreślić, że witaminy dzielimy na rozpuszczalne w tłuszczach i rozpuszczalne w wodzie. Do pierwszych zaliczamy witaminy A, D, E i K, natomiast do rozpuszczalnych w wodzie - witaminy z grupy B oraz witaminy C i H. Większość witamin to koenzymy wielu enzymów - związków chemicznych kluczowych dla procesów życiowych. Organizm człowieka nie jest w stanie sam wytwarzać witamin, dlatego muszą być one dostarczone wraz z pożywieniem - w postaci owoców i warzyw.

Jedną z witamin o bardzo szerokim spektrum działania jest witamina C (kwas askorbowy, askorbinowy). Dawniej witaminę C nazywano czynnikiem przeciwgnilnym, a askorbowy znaczy z łaciny „bez szkorbutu'. Przed jej odkryciem bowiem umierało na tę chorobę od połowy do dwóch trzecich załóg statków odbywających długie rejsy, których marynarze jedli tylko kaszę i mięso. Dopiero wprowadzenie do diet produktów bogatych w witaminę C, na przykład: cytryn, kapusty kiszonej, zmieniło sytuację na lepsze.

Pierwsze informacje o wyizolowaniu kwasu askorbowego z produktów naturalnych pochodzą z 1928 roku. W tym roku Szent-György uzyskał z wyciągów z nadnerczy, kapusty i pomarańczy związek, który wykazywał właściwości oksydo-redukcyjne. Związek ten został nazwany przez niego kwasem heksuronowym. W 1932 roku Wang i King otrzymali witaminę C z cytryny. Rok później Haworth, Hirst i współpracownicy ustalili budowę chemiczną witaminy C. W latach 1933-34 Reichstein i współpracownicy dokonali syntezy kwasu askorbowego. Chociaż od odkrycia witaminy C minęło wiele lat, ciągle wiele badań naukowych poświęca się zgłębieniu wiedzy na jej temat oraz poszukiwaniu nowych zastosowań kwasu askorbowego w medycynie, kosmetyce i innych gałęziach przemysłu. Wykazano na przykład, że połączenie terapii przeciwnowotworowej z podawaniem witaminy C znacznie łagodzi skutki radioterapii i sprzyja szybkiemu powrotowi do zdrowia. Ponieważ kwas askorbowy chroni skórę przed działaniem wolnych rodników, słońca i przed starzeniem znalazł ogromne zastosowanie w kosmetyce. Ponadto kwas askorbowy oraz jego sole i estry są przeciwutleniaczami powszechnie stosowanymi w przemyśle spożywczym.

Budowa i właściwości fizykochemiczne witaminy C

Kwas askorbowy o wzorze sumarycznym C₆H₈O₆ jest związkiem o prostej strukturze, zbliżonej do cukrów prostych. Chemicznie jest sześciowęglowym ketolaktonem, strukturalnie podobnym do glukozy i innych heksoz. Obecność dwóch asymetrycznych węgli powoduje występowanie czterech czynnych optycznie form izomerycznych kwasu askorbowego (Rys. 1a). Aktywna biologicznie witamina C jest prawoskrętna i ma konfigurację L (kwas L(+)-askorbowy; γ-lakton kwasu 2,3-dehydro-L-gulonowego; kwas L-treo-2-enonowy), forma kwasu D-askorbowego jest 20 razy mniej aktywna.

a)

b)

Rys. 1. Izomery kwasu askorbowego (a), ugrupowanie endiolowe (b).

Najbardziej charakterystycznym fragmentem cząsteczki kwasu L-askorbowego jest ugrupowanie endiolowe (Rys. 1b), które warunkuje kwasowy charakter i właściwości redukujące tego związku. Natomiast pięcioczłonowy pierścień laktozowy odpowiedzialny jest za stabilizację całej cząsteczki.

W przyrodzie kwas L-askorbowy występuje w dwóch formach: zredukowanej (kwas askorbowy) i utlenionej (kwas dehydroaskorbowy). Obie formy mogą być jednakowo wykorzystywane przez organizm człowieka. Utlenianie kwasu askorbowego do dehydroaskorbowego jest reakcją odwracalną (Rys. 2), natomiast dalsze utlenianie prowadzi do pochodnej, która nie posiada aktywności witaminy C - kwasu diketogulonowego.

Rys. 2. Reakcja odwracalnego utleniania witaminy C; (a) kwas askorbowy, (b) kwas dehydroksyaskorbowy.

Łatwość dysocjacji protonu grupy hydroksylowej przy C-4, jak również wcześniej wspomniana obecność wiązania endiolowego, warunkują jego kwasowy charakter. Potwierdza to łatwość tworzenia soli, np. asorbinianu sodu lub wapnia. Witamina C rozpuszcza się łatwo w wodzie oraz rozcieńczonym alkoholu metylowym i etylowym. Nie rozpuszcza się natomiast w tłuszczach i ich rozpuszczalnikach.

Kwas L-askorbowy ma zdolność tworzenia estrów z kwasami, a najbardziej znanym jest 6-palmitynian askorbinylu - substancja krystaliczna, bezbarwna lub o słabym żółtawym odcieniu, słabo rozpuszczalna w wodzie, a dobrze w tłuszczach i rozpuszczalnikach organicznych.

Zdolność tworzenia układu redox - odwracalnego utleniania i redukcji, jest najważniejszą właściwością witaminy C, która warunkuje jej działanie. Utlenianie kwasy L-askorbowego zachodzi pod wpływem chlorku żelaza(III), nadtlenku wodoru, nadmanganianu potasu, natomiast redukcja pod wpływem np.: jodowodoru lub siarkowodoru.

Metoda chemiczna oznaczania witaminy C - metoda Tillmansa

Metoda Tillmansa oparta jest na redukcji 2,6-dichlorofenoloindofenolu (barwnik Tillmansa) przez kwas L-askorbinowy. Przebieg reakcji przedstawiono na Rys. 3.

Rys. 3. Przebieg reakcji redukcji 2,6-dichlorofenoloindofenolu przez kwas L-askorbinowy.

Metoda ta sprowadza się do miareczkowania roztworu kwasu L-askorbinowego barwnikiem Tillmansa do momentu pojawienia się jasno różowego zabarwienia. Jest to metoda prosta, ale tylko w przypadku roztworów bezbarwnych i niezawierających innych związków powodujących redukcję odczynnika Tillmansa. W praktyce wiadomo, że większość surowców roślinnych zawiera barwniki antocyjanowe, które nadają ekstraktom witaminy C różowe zabarwienie, a także mają właściwości redukujące. Ponadto w produktach, w których oznaczany witaminę C, występują inne związki ulegające utlenieniu podczas miareczkowania odczynnikiem Tillmansa. Należą do nich reduktony - związki obdarzone silnymi właściwościami redukującymi, które należy przypisywać obecności ugrupowania endiolowego. W przypadku oznaczania witaminy C w owocach i warzywach oraz ich przetworach mamy do czynienia z reduktonami białkowymi (aminokwasy lub białka zawierające grupy sulfhydrylowe, które są utleniane przez odczynnik Tillmansa do wiązań disulfidowych) oraz cukrowymi (pochodne cukrów, które powstają podczas obróbki termicznej).

W przypadku roztworów silnie zabarwionych stosuje się modyfikację metody Tillmansa, tzn. miareczkowanie 2,6-dichlorofenoloindofenolem w obecności rozpuszczalnika organicznego (chloroform, ksylen). Wykorzystuje się tu fakt zróżnicowanej rozpuszczalności.

Barwniki antocyjanowe, w odróżnieniu od barwnika Tillmansa, nie rozpuszczają się w rozpuszczalniku organicznym, natomiast barwnik Tillmansa rozpuszcza się. Nadmiarowa kropla 2,6-dichlorofenoloindofenolu przechodzi do warstwy rozpuszczalnika barwiąc go na różowo.

1. Cel i zakres ćwiczenia laboratoryjnego

Przedmiotem ćwiczenia jest poznanie budowy i podstawowych właściwości witamin. Celem jest wyizolowanie i ilościowe oznaczenie witaminy C w wybranym produkcie spożywczym.

2. Przebieg realizacji eksperymentu

Doświadczenie 1. Izolowanie i ilościowe oznaczenie kwasu askorbinowego.

Odczynniki i materiały:

1. jabłka (lub inny owoc, sok z kiszonej kapusty, sok z cytryny, papryka)

2. roztwór 2,6-dichlorofenoloindofenolu: 40 mg barwnika rozpuścić w 25-30 cm³ gorącej wody destylowanej, oziębić wodą wodociągową i uzupełnić do 50 cm³ wodą destylowaną. Bezpośrednio przed użyciem rozcieńczyć 1:15 lub 1:20 (H₂O).

3. kwas askorbinowy (czysty, do próby kontrolnej)

4. jodek potasu

5. kwas siarkowy (VI) 1 mol/dm³

6. tiosiarczan sodu 0,001 mol/dm³

7. roztwór skrobi

8. kolba stożkowa z doszlifowanym korkiem

9. moździerze lub sokowirówka

10. biurety 25 cm³

11. wirówka lub gęsta gaza

12. łaźnia wodna

Wykonanie:

Oznaczenie miana 2,6-dichlorofenoloindofenolu przez miareczkowanie roztworem tiosiarczanu sodu

W kolbie stożkowej z doszlifowanym korkiem o pojemności 50 cm³ rozpuścić 100 mg jodku potasu w 5 cm³ kwasu siarkowego (VI) o stężeniu 1 mol/dm³, dodać szybko 10 cm³ roztworu 2,6-dichlorofenoloindofenolu, kolbę zamknąć i pozostawić na 10 minut w ciemnym miejscu. Wydzielony jod odmiareczkować roztworem tiosiarczanu sodu (0,001 mol/dm³), dodając 1 cm³ roztworu skrobi. Miareczkowanie powtórzyć 3 razy.

Oznaczanie witaminy C w soku z owoców lub warzyw

Jabłko (lub inny owoc, sok z kiszonej kapusty, sok z cytryny, papryka) obrać, zważyć, pokroić na drobne kawałki i rozetrzeć w moździerzu. Powstały homogenat odwirować przy 15000 x g lub wycisnąć sok i zmierzyć jego objętość. Przy dokładnych oznaczeniach osad ponownie zawiesić w wodzie destylowanej, wymieszać i odwirować. Nasącza połączyć, zmierzyć ich objętość i rozcieńczyć 1:0,5 lub 1:1 wodą destylowaną (gdy nie stosowano drugiego wymycia). W celu oznaczenia zawartości witaminy C z każdej próby pobrać po 10 lub 15 cm³ i miareczkować roztworem 2,6-dichlorofenoloindofenolu do różowego zabarwienia utrzymującego się 10 sekund. Równolegle wykonać próbę kontrolną, w której określoną i rozpuszczoną w wodzie naważkę witaminy C miareczkujemy roztworem 2,6-dichlorofenoloindofenolu. Zawartość witaminy w produktach obliczyć na podstawie ilości zużytego barwnika w przeliczeniu na całkowitą ilość użytego surowca. Do obliczeń przyjąć ilość zużytego roztworu barwnika pomniejszoną o ilość ml barwnika zużytą w próbie ślepej. Obliczyć ilość poszczególnych owoców i warzyw, które całkowicie pokrywają zapotrzebowanie człowieka na witaminę C w ciągu doby.

Opracowanie wyników

1) Obliczyć miano roztworu 2,6-dichlorofenoloindofenolu. Za miano roztworu tego barwnika przyjmuje się ilość mg kwasu askorbinowego utlenianego przez 1 cm³ tego roztworu. Aby obliczyć miano barwnika, należy obliczyć jego stężenie molowe (CM) na podstawie reakcji z tiosiarczanem sodu, w której na 1 mol barwnika przypadają 2 mole tiosiarczanu:

VW - objętość tiosiarczanu sodu zużytego do zmiareczkowania roztworu barwnika [ml],

VZ - objętość tiosiarczanu sodu zużytego do miareczkowania w próbie zerowej [ml],

CT - stężenie roztworu tiosiarczanu sodu [mol/l],

Vb - objętość roztworu barwnika [ml].

2) Na podstawie ilości barwnika zużytego do miareczkowania rozcieńczonego soku z owocu, obliczyć zawartość witaminy C (bezpośrednia redukcyjność).

Oznaczanie czystej witaminy C

W celu oznaczenia zawartości witaminy C pobrać po 2 cm³ (I grupa), 3 cm³ (II grupa), 4 cm³ (III grupa), 5 cm³ (IV grupa), dodać 2 krople HCl i miareczkować trzy razy roztworem 2,6-dichlorofenoloindofenolu do różowego zabarwienia utrzymującego się 10 sekund.

Policzyć stężenie witaminy C na podstawie wzoru:

C_{wit. c} = C_{2,6-dichlorofenoloindofenolu} · V_{2,6-dichlorofenoloindofenolu}

Opracowanie wyników

Wyniki zestawić w tabeli:

Tabela wyników:

	Trial 1	Trial 2	Trial 3
Stężenie 2,6-dichlorofenoloindofenolu
Objętość 2,6-dichlorofenoloindofenolu
Zawartość witaminy

Średnia zawartość witaminy C ____________

Odchylenie standardowe _________________

Wymagania

1. Co to są witaminy? Podział witamin. Znajomość podstawowych witamin i produktów spożywczych, w których występują w znacznych ilościach.

1

7

a)

Kwas L(+)askorbowy

Kwas L(-)askorbowy

Kwas D(-)izoaskorbowy

Kwas D(+)izoaskorbowy

b)

---