Immunologia skrypt, Immunologia

I. Reakcje antygen-przeciwciało

Immunizacja zwierząt-szczepianie zwierząt, wytworzenie przeciwciał w odpowiedzi poliklonalnej - mieszanina różnych przeciwciał ,

Surowica monowalentna- reaguje z 1 antygenem

Surowica poliwalentna- reaguje z wieloma antygenami

Przeciwciała monoklonalne otrzymuje się łacząc limfocyty z komórkami nowotworowymi (produkują przeciwciała poza organizmem)

Metody jakościowe

1.Reakcja precypitacji w roztworze

-dotyczy antygenów wielodeterminantowych i co najmniej 2 wartościowych przeciwciał rozpuszczonych w roztworze

-słabe siły, niekowalencyjne, utrzymują kompleks immunologiczny

-większość kompleksów Ab-Ag zależy od stosunku stężeń obu składników,

- ilość składników ma wpływ na strukturę powstających kompleksów

-gdy rosnące stężenia antygenu dodaje się do stałej ilości przeciwciał, ilość tworzonych kompleksów immunologicznych rośnie, a następnie maleje. Powstała w ten sposób krzywa Heidelberga ma 3 strefy:

strefa nadmiaru przeciwciał :ilość antygenu jest zbyt mała ,aby przereagować i wytrącić wszystkie przeciwciała , w nadsączu obecne wolne przeciwciała
strefa równowagi(ekwiwalencji): ilość antygenu jest wystarczająca ,aby przereagować i wytrącić wszystkie przeciwciała , w nadsączu brak wolnych przeciwciała i wolnego antygenu, tworzą się makromolekuły-max. efekt zmętnienia
strefa nadmiaru antygenu : ilość antygenu przewyższa ilość wymaganą do wytrącenia wszystkich przeciwciał, zmniejsza się ilość kompleksów -rozpadają się one w nadmiarze antygenu( konkurencja o miejsce w przeciwciałach)

2.Reakcje precypitacji w żelu: podwójna dyfuzja wg Ouchterlony'ego

-umożliwia rozróżnienie reakcji antygenu z różnymi przeciwciałami obecnymi w surowicy(surowica poliwalentna-reaguje z wieloma antygenami) - odczyn podwójnej dyfuzji w żelu

-w zastygłym na szkiełkach żelu agarozowym wycina się studzienki, w których umieszcza się roztwory Ab i Ag, które promieniście dyfundują

-czas:10-12h

-w wyniku reakcji powstaje linia precypitacyjna, jeśli zostanie zachowany warunek równowagi

-położenie linii zależy od stężeń składników lub wielkości cząsteczek

-możliwość badania relacji miedzy przeciwciałami:

identyczność: łagodne przejście -łuki precypitacyjne wytworzone pomiędzy przeciwciałem a 2 Ag łączą się - Ab precypituje identyczne epitop w każdym z 2 testowanych Ag

brak identyczności: Ab rozróżnia 3 różne antygeny tworzące niezależne linie, wieksze Ag dyfunduja wolniej
częściowa identyczność: ostroga + linia identyczności - Ag maja wspólny 1 epitop,a dodatkowo jeden z nich ma 2 epitop

-zastosowanie: diagnostyka białek w moczu

-czułość metody: 20µg/ml - 2mg/ml

3.Immunoelektroforeza (elektroimmunodyfuzja)

-zastosowanie:gdy dużo antygenów w mieszaninie

-przed uwidocznieniem reakcji na drodze precypitacji antygeny rozdziela się w oparciu o ich ładunek elektryczny

-antygeny ze studzienek wyciętych w zelu sa rozdzielane w polu elektrycznym

-pH żelu jest tak dobrane,ze białka naładowane + wędrują do katody,a - do anody.

-pomiedzy studzienkami wycina się rowek i wypełnia się go przeciwciałami

-Ab i Ag dyfunduja do żelu i tworza łuki

-miano surowicy- najniższe stężenie surowicy odpornościowej, które daje jeszcze widoczną reakcję precypitacji dla małego stężenia antygenu

Metody ilościowe

4.Immunodyfuzja radialna

-pozwala na ilościowa ocenę reakcji i antygenów

-Ab dodaje się do żelu przed jego zestaleniem na szkiełku

-do wyciętych w żelu studzienek dodaje się te same obj. standardu o różnych stężeniach i badanych próbek

-24h inkubacja

-Ag dyfunduje tworząc kompleksy az do ustalenia się stanu równowagi, co ujawnia się powstaniem pierścienia precypitacji

-pole krążka(d²) jest proporcjonalne do stężenia antygenu

-wartości nieznane odczytuje się z krzywej standardowej

5.Elektroforeza przeciwprądowa

-wykonuje się w żelu, którego pH jest tak dobrane, aby Ab miało ładunek dodatni Ag ujemny

-jest to możliwe w większości wypadków, bo Ab maja stosunkowo wysoki punkt izoelektryczny ( są obojętne w bardziej zasadowym pH niż większość Ag)

-gdy ładunki antygenu i przeciwciała nie różnią się wystarczająco, można dokonać modyfikacji chemicznej aby zmianie ich punkt izoelektryczny

-po umieszczeniu w polu elektrycznym Ag i Ab zbliżają się do siebie i powstaje precypitat

-czułość:10-20 razy wyższa niż w podwójnej precypitacji

6.Elektroeforeza rakietowa

-ilościowa metoda elektroforetyczna w obecności specyficznych przeciwciał znajdujących się w żelu

-pozwala na oznaczenie stężenia Ag dokonując jego elektroforezy w żelu zawierającym Ab

-odpowiednio dobrane pH sprawia ze Ab nie mają ładunku, a Ag ma ładunek ujemny

-tworzące się precypitaty mają kształt rakietek, w których wysokość jest proporcjonalna do stężenia antygenu

-wartości badanych próbek oblicza się z krzywej standardowej

7.Metoda nefelometrii

-ocenia stężenie r-ru powstałe w wyniku reakcji miedzy Ag a specyficznym Ab

-ocenia osłabienie wiazki świetlnej po przejściu przez roztwór

-ocenia stopień rozproszenia wiązki świetlnej (detektory nastawione miedzy 45º-90º)

- metoda analizy stężenia lub składu molekularnego roztworu na podstawie pomiaru natężenia światła rozproszonego przez zawiesinę.

- wykorzystywany jest efekt Tyndalla

-zalety: szybka, jednostopniowa

-przy małych stężeniach, niskocząsteczkowe kompleksy

-stosuje się krzywą standardową

II. Wykrywanie paraproteinemii i dysproteinemii

Paraproteiny- białka monoklonalne- jednakowe, pochodzą z 1 źródła, pojawiają się w stanach chorobowych w skutek uzlośliwienia komórek produkujących przeciwciała np. limfocytów B. Te przeciwciała przypominaja strukturalnie Ig, ale najczęściej nie maja funkcji biologicznej. Białka te mogą być również zdefragmentowane lub w postaci łańcuchów ciężkich lub lekkich.

1.Elekroforeza w żelu agarozowym

-technika stosowana przy rozdziale , analizie i oczyszczaniu białek

-pozwala określić liczbę występujących frakcji białkowych w surowicy krwi(pH 8,6)

albuminy
α1
α2
β1
β2
γ -szeroki

-polega na ruchu naładowanych cząsteczek lub ich kompleksów względem nieruchomej cieczy pod wpływem przyłożonego napięcia

-podczas elektroforezy możliwe jest rozdzielenie cząsteczek o tej samej wielkości, ale zróżnicowanych pod względem kształtu

-metoda szybka, prosta, powszechnie stosowana.

-zdolność rozdzielcza zależy od wielkości porów w żelu , których rozmiary są zdeterminowane przez stężenie agarozy.

-przeciwciała wędrują z różnymi klasami białek np. IgG od γ do α2 (głównie z γ)

-bialka monoklonalne-zwarte pasma o dużej barwliwości

-białka poliklonalne-szerokie pasma silnie wysycane barwnikiem

2.Immunoelektroforeza prosta wg Scheideggera

-2 etapowa

etap I: rozdziała elektroforetyczny mieszaniny antygenów w żelu agarozowym (podział ze względu na ładunek i mase)
etap II: immunodyfuzja antygenów i przeciwciał, które dodaje się do żelu wzdłuż drogi rozdziału

-w wyniku reakcji Ab+Ag powstają linie precypitacyjne zwane łukami, których położenie, kształt, wielkość, wybarwienie porównuje się z płynem kontrolnym (mieszanina Ag w prawidłowych stężeniach)

-użycie surowicy monowalentnej-pojedyncze łuki

- użycie surowicy poliwalentnej-wiele łuków

-interpretacja obrazów immunoforetycznych- porównanie wyników z płynem kontrolnym w tych samych warunkach i tym samym czasi

-przy ocenie bierze się pod uwagę zmiany jakościowe i ilościowe, które mogą być wyrażone przez:

obecność lub brak danej linii precypitacyjnej
szerokość wyników ć, kształt, położenie łuku
ostrość obrazu
intensywność barwy precypitatu
zmianę w ruchliwości elektroforetycznej frakcji
pojawienie się dodatkowych łuków

-kontrola u góry, pacjent na dole

-do badania trzeba mieć poliwalentne i monowalentne przeciwciała IgG, IgM, IgA łańcuchy lekkie

-fizjologicznie więcej przeciwciał ma łańcuchy κ niż λ (stała gatunkowa: 2/3 : 1/3)

-stosunek κ do λ ma znaczenie diagnostyczne

λ = 1,2 - 2,6 (zawsze przewaga κ)

-przy pojawieniu się paraprotein będzie wzrastał lub malał

-przy hipo i hiperimmunoglobulinemi nie zmienia się

-zniekształcenie łuków precypitacyjnych-komórki prawidłowe ubywają a komórki nowotworowe wytwarzają więcej przeciwciał (pogrubienie łuków w tym miejscu)

-brak albumin- inne białka przejmuja ich funkcje

-zastosowanie:

do określania czystości wyizolowanego antygenu
do kontroli procesu immunizacji
do określania specyficzności przeciwciał

-wady:

-niska czułość(60%)

-trudna interpretacja

-stosunkowo długi czas odczytywania wyników(min 48h)

-zalety

+ilość informacji o pacjencie

3.Immunofiksacja

-2 etapowa

etap I: rozdział elektroforetyczny mieszaniny antygenów w żelu agarozowym w kilku powtórzeniach(ok. 6) w tym samym czasie
etap II: immunoprecypitacja antygenów w reakcji ze swoistymi Ab

-tworzą się pasma precypitacyjne w wyniku reakcji Ag-Ab, których położenie porównuje się z rozdziałem kontrolnym pacjenta

-1 ścieżka: kontrolna własna pacjenta

-pozostałe ścieżki: IgG, IgM, IgA, κ , λ

-zatrzymywane sa tylko duze kompleksy, a to co nie utworzy kompleksów jest wypłukiwane i tego nie widzimy

-wady:

-wymaga bardzo dobrej jakości przeciwciał monoklinalnych, które sa bardzo drogie

-zalety:

+szybkość: 2-3h

+łatwość interpretacji

+czułoćś(>90%)

Paraproteiny

-zbudowane często tylko z 1 typu łańcuchów lekkich lub ciężkich

-w elektroforezie homogenie białko wedruje w postaci wąskiego ograniczonego pasma

4.Immunoelektroforeza dwuwymiarowa(krzyżowa)

-2 etapowa

etap(wymiar) I: elektroforeza wysokonapięciowa -rozdział Ag w żelu agarozowym (szybko-30min)
etap II: elektroforeza niskonapięciowa -rozdział Ag w obecności Ab prowadzony pod kątem 90º do pierwszego (wolno)

-wynik reakcji: łuki precypitacyjne,których pole powierzchni jest wprostproporcjonalne do stężenia Ag, a odwrotnieproporcjonalne do stężenia Ab

-cel: jakościowe badanie różnic w składzie białek

-kilka szczytów połaczonych 1 linią - Ab są podobne antygenowo

-kilka szczytów przecinających się - odrębne Ab

III.Zastosowanie technik immunoenzymatycznych fazy stałej w diagnostyce medycznej

Reakcja Ab-Ag daje wielkie, usieciowane, precypitujące kompleksy.

Kompleksy w żelu nie zawsze precypitują.

Kompleksy możemy uwidocznić wiążąc je do fazy stałej i znakując.

Techniki fazy stałej

- kompleks Ab-Ag wiąże się na stałym podłożu, używa się znakowanych Ab

Faza stała - płytka polisyntetyczna, wiązania mogą być hydrofobowe, hydrofilne, kowalencyjne

Inkubacja 2h w 30˚C -białka z surowicy wiążą się do powierzchni płytki w stężeniu takim jak w surowicy. Potem wlewa się do tych kuwet przeciwciała w nadmiarze- ilość kompleksów zależy od ilości Ag w próbie. Przed doświadczeniem wiąże się Ab ze znacznikiem.

Znaczniki stosowane w technikach fazy stałej:

izotopy promieniotwórcze (¹²⁵I, ³H) -wiązania kowalencyjne z Ab, włączają się w miejsca wiązań podwójnych w białkach, promieniowanie zmierzone po próbie odpowiada ilości kompleksów Ab-Ag, a wiec ilości Ag w próbce
enzymy(peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna) - najpowszechniej stosowane, bo nie są tak szkodliwe jak izotopy; wiązania kowalencyjne przez wiązania boczne miedzy resztami kwasowymi lub zasadowymi; uzyskuje się białkową, która będzie mogła wykryć Ag; do studzienek dodaje się substratu dla enzymu; po reakcji mierzymy ekstynkcje.
fluorochromy(FITC-izotiocjanian fluoresceiny, TRIC-izotiocjanian tetrametlrodaminy, PE-fikoerytryna, chlorek dansylu)- są czułe jak izotopy, ale nieszkodliwe; są zdolne do pochłonięcia kwantu energii i emisji światła; droższe
lantanowce(europ)
biotyna/awidyna- wieksza niż w przypadku enzymów czulość
złoto koloidalne

Techniki wykorzystujące znaczniki:

1.ELISA - Test immunoenzymatyczny

-w tej metodzie albo Ab albo Ag jest związane z enzymem

-antygen zawieszony w soli fizjologicznej inkubuje się na plastikowej płytce lub próbówkach, co prowadzi do zaadsorbowania jego niewielkiej ilości do plastiku

-wolny antygen odpłukuje się

-dodaje się r-r przeciwciała, które wiąze się z Ag

-niezwiązane Ab odpłukuje się

-przeciwciało wykrywa się za pomocą swoistego ligandu związanego kowalencyjnie z enzymem, np. peroksydazą

-odpłukanie niezwiązanego ligandu

-związany ligand wykrywa się przez dodanie chromogenu(bezbarwnego substratu), który pod wpływem peroksydazy jest źródłem barwnego produktu

-ilość związanego przeciwciała ocenia się mierzac kolorymetrycznie barwny produkt

2.RIA (radioimmunoassay)- Metody radioimmunologiczne

- ligandem jest bialko związane z radioizotopem, które wiąże się kowalencyjnie z Ab

-duza liczba oznaczen w krotkim czasie

-wysoka czułość

3.Immunofluorescencja(IFA)

-zastosowanie: wykrywanie autoprzeciwciał i przeciwciał skierowanych przeciw tkankom i antygenom komórkowym, wykrywanie antygenów in situ na skrawkach tkankowych, wykrywanie antygenów na komórkach żywych w celu identyfikacji komórek w zawiesinie

- zasada: w reakcji Ab-Ag uczestniczy jeden ze składników znakowany fluorochromem

-antygeny znakowane fluorochromem są rzadko stosowane

metoda bezpośrednia(DIF):

- badany roztwór przeciwciał sprzężonych z fluorochromem nakrapla się na skrawek i po inkubacji spłukuje

-przeciwciala związane ze skrawkiem wykrywa się w mikroskopie

-wzór fluorescencji jest znamienny dla danego antygenu tkankowego

o>-*

metoda pośrednia(IIF):

- badany roztwór przeciwciał nakrapla się na skrawek i po inkubacji spłukuje

- dodanie przeciwciał sprzężonych z fluorochromem, które sa antyglobulina dla pierwszego przeciwciała i reagują z nim

o>->-*

metoda pośrednia wzmocniona udziałem dopelniacza

- badany roztwór przeciwciał nakrapla się na skrawek i po inkubacji spłukuje

- dodanie C ,który wiąze się w miejscach związanych przeciwciał

- do jednego przeciwciała może się przyłączyć wiele czasteczek C3b

- po inkubacji i spłukaniu dodajemy przeciwciała anty-C3 znakowane fluorochromem

o>-0>-*

4.Immunoblotting(przeniesienie immunologiczne)

-zastosowanie: wykrycie i scharakteryzowanie nieznanych wcześniej antygenow obecnych w mieszaninie

-miesznine antygenów rozdziela się na żelach analitycznych

żel poliakrylamidowy zawierający SDS(siarczan dodecylu sodu)
żel do ogniskowania izoelektrycznego
żel do mapowania peptydów

-uzyskanie informacji o wielkości, punkcie izoelektrycznym, molekularnych zależnościach badanych antygenów

- następnie molekuły przenosi się na błony nitrocelulozowe(poliwinylowe w przypadku znacznikow fluorscencyjnych) w komorach do blottingu

- uzyskane w ten sposób blony inkubuje się z przeciwciałami i spłukuje nadmiar

-zwiazane z rozdzielonym materiałem przeciwciała uwidacznia się za pomocą przeciwciał antyglobulinowych znakowanych radioizotopami

-po kolejnym płukaniu błonę umieszcza się na kliszy i inkubuje

-wywołanie i utrwalenie autoradiogramu

-uwidocznienie miejsc, w których doszlo do reakcji

-technikę można zmodyfikowac używając przeciwciał znakowanych enzymem

-w tym przypadku wykrywa się związanie przeciwciała inkubujac błony z chromogenem

-pojawiają się nierozpuszczalne barwne złogi na błonie, w miejscu, gdzie związały się przeciwciała znakowane enzymem

-dobrym znacznikiem jest biotyna, mimo iż wymaga dodatkowej inkubacji i przemywan

-po inkubacji z surowica dodaje się przeciwciał znakowanych biotyną i płucze

-dodanie awidyny, która swoiście łączy się z biotyna i płukanie

-dodanie substratu i przemycie

-barwna reakcja-uwidocznienie prążków

5.Elektroforeza w zelu poliakryloamidowym(PAGE)

-zalety:

+duża rozdzielczość

-zastosowanie: rozdzielanie i oczyszczanie białek

-PAGE-SDS: wyznaczanie masy cząsteczkowej bialek

-bialka poddane denaturacji termicznej(100˚) w obecności SDS i redukcji przez merkaptoetanol w celu zerwania wiązań disiarczkowych całkowite rozwiniecie struktury białka

-SDS opłaszcza zdenaturowane białko, tworząc wydłużone micelle

-białka wykazuja wypadkowy ładunek ujemny i identyczny stosunek ładunku do masy

-długość miceli jest proporcjonalna do dlugości łańcucha polipeptydowego, a tym samym do masy cząsteczkowej bialka

-podstawe rozdziału stanowi różnica wielkości mas

Wykorzystanie testów płytkowych fazy stałej:

1.Oznaczanie pełnowartościowych antygenów

Antygeny oznacza się wykorzystując ich zdolność do równoczesnego wiązania dwóch przeciwciał lub za pomocą testów opartych na rywalizacji o wiązanie (reakcje kompetycyjne) stosując różne znaczniki dla detekcji.

test podwójnego wiązania

-na płytkę pokryta swoistym przeciwciałem nanosimy badana próbę

-obecny w próbce antygen łączy się z przeciwciałem podczas inkubacji

-po odplukaniu niezwiązanego materiału związany antygen wykrywa się używając znakowanych przeciwciał reagujących z innym epitopem antygenu

-jeśli przeciwciało jest znakowane enzymem to po dodaniu substratu mierzymy ekstynkcje

-test jest bardzo czuły i swoisty bo antygen wykrywany jest przez 2 różne przeciwciała, z których drugie jest w nadmiarze

-warunek: Ag posiada 2 miejsca „uchwytu”dla przeciwciał

-zastosowanie przeciwciał monoklonalnych -rozpoznają tylko 1 determinante antygenowa

-najlepiej aby przeciwciała wychwytujące (w podlożu)wykrywaly inne determinanty niż przeciwciała detektorwe(znakowane)

-zastosowanie:

hormony białkowe
markery nowotworowe
inne białkowe markery schorzeń(np. AFP)
cytokiny

test kompetycyjny(rywalizacji)

-na płytkę pokryta swoistym przeciwciałem nanosimy badana próbę zawierającą szukany antygen i jednocześnie antygen znakowany

-im więcej antygenu w próbce tym mniej znakowanego antygenu ma szanse się związać

-zastosowanie:

pomiar stosunkowo dużych ilości antygenu
pomiar stężenia hormonów, które posiadaja tylko jedno rozpoznawane przez przeciwciało miejsce wiazania

2. Oznaczanie przeciwciał o określonej specyficzności

oznaczanie IgG i IgE

-antygen zawieszony w soli fizjologicznej inkubuje się na plastikowej plytce, co prowadzi do zaadsorbowania się jego niewielkiej ilości do plastiku

-wolny antygen odpukuje się

-dodanie roztworu badanego przeciwciała(surowicy)

-inkubacja i odpłukanie niezwiązanego bialka

-wykrycie przeciwciał za pomoca znakowanych, zwierzęcych przeciwciał skierowanych przeciwko ludzkim Ig lub za pomoca swoisteo ligandu sprzężonego z dowolnym znacznikiem(np.gronkowcowe bialko A,które wiąże się z fragmentem Fc IgG)

-uzywajac ligandów swoiście rozpoznających określone klasy i podklasy badanego przeciwciała można ustalić jego izotop

-niezwiazany ligand lub przeciwciała spłukuje się

-oznacznie związanego z płytka znacznika

-poziom przeciwciał można precyzyjnie wyznaczyć z krzywej miareczkowania

-czułość:1-50ng/ml swoistego przeciwciała

-zastosowanie:

wykrywanie infekcji(Helicobacter pylori, Borrelia burgdorferi, WZW,HIV)
identyfikacja alergenów(IgE)
choroby związane z autoagresją

oznaczanie IgM

-na płytce znajduja się zwierzęce przeciwciała przeciwko ludzkim IgM(anty-h-IgM)

-dodanie surowicy ludzkiej

-przyłączenie się wszystkich typów IgM (gdy grupa to tez IgM przeciwko jej wirusowi )

-dodanie znakowanego antygenu Borrelii w celu identyfikacji szukanych IgM

-wynik negatywny może zawodno świadczyć o braku choroby ale i również o tym iż choroba znajduje się już w poznym stadium i jest konieczna radykalna antybiotykoterapia

-wykrycie IgM(odpowiedni poziom przeciwciał w surowicy) można dopiero po 3-6 tygodniach po zakazaniu zbadać

-zastosowanie:

wykrywanie wczesnej fazy infekcji ( Borrelia burgdorferi)

-wady:

-niska swoistość(pewne Ag bakteryjne mogą mieć podobną budowe i dawać wynik pozytywny)

3.Oznaczanie haptenów (niepełnowartościowych przeciwciał)

test kompetycyjny(rywalizacji)

-na płytce znajduja się przeciwciała

-najpierw dodajemy znakowane hapteny9niskoczasteczkowe znaczniki) i mierzymy fluorescencje

-dodajemy surowicy lub moczu z haptenami i mierzymy ekstynkcje

-im wiecej haptenow tym mniejsza fluorescencja

-zastosowanie:

hormony sterydowe
hormony tarczycy
pochodne sterydowe w moczu (np. kontrola antydopingowa)
markery niskocząsteczkowe
pozom leków w ustroju

4.Testy nitrocelulozowe

-na nitrocelulozie są 2 paski: pasek kontrolny- zawiera poszukiwany antygen

pasek testowy- zawiera przeciwciała skierowane przeciwko

temu antygenowi

-na początku testu znajduja się również przeciwciała przeciwko antygenowi znakowane złotem koloidalnym (różowy kolor)

-po dodaniu badanego materiału(krew, mocz) antygeny zawarte w nim przepływając przez test łącza się z znakowanymi przeciwciałami i wędrują do pasków

-do paska testowego przyłączają się kompleksy

-do paska kontrolnego przyłączają się wolne Ab znakowane

-wynik pozytywny: zabarwienie obu pasków

-wynik negatywny: wybarwienie paska kontrolnego

-zastosowanie:

test ciążowy
Helicotest
test na obecność narkotyków w moczu(5 pasków)

5.Immunoblotting(Western blotting)

-antygeny wirusa lub inne rozdziela się na żelu poliakrylamidowy zawierający SDS

-przeniesienie antygenu na blone nitrocelulozową w komorze

-dodanie surowicy i przyłączenie znajdujących się w niej przeciwciał do antygenów na bł

-wypłukanie niezwiązanych bialek

-dodanie immunoglobulin skierowanych przeciwko ludzkim Ig ,znakowanym

-dodanie substratu(gdy Ab sa znakowane enzymem)-powstanie barwnych prążków

-zastosowanie:

diagnostyka zakażeń wirusem HIV

-testy przesiewowe: faza stała opłaszczona antygenami obu typów(HIV1 i HIV2), przy wyniku pozytywnym -różnicowanie który typ

-testy potwierdzenia: na paskach rozdzielone cząsteczki wirusa różniące się masami, dodanie surowicy, odpowiednie antygeny wiazą odpowiednie przeciwciała

diagnostyka zespołu obniżonej glikozylacji glikoprotein

-brak 1 enzymu powoduje zablokowanie przyłaczania 1 cukru

-brak kwasu sjalowego na koncu znacznie podnosi punkt izoelektryczny

IV. Techniki izolacji komórek immunologicznie kompetentnych z płynów komórkowych i tkanek litych

Diagnostyka immunologiczna:

-badanie komórek

-oznaczanie stężenia Ig we krwi

-próby czynnościowe poszczególnych elementów układu odpornościowego

Źródla komórek do badań nad zwierzętami:

-grasica

-śledziona

-obwodowe węzły chłonne

-kepki Peyera

Źródla komórek do badań u ludzi:

-limfocyty krwi obwodowej

-śledziona

-migdałki

-wezły chłonne

Populacje komórkowe uzyskane z poszczególnych tkanek sa zupełnie różne.

Techniki izolacji komórek immunologicznie kompetentnych

1.Metody fizyczne

izolacja na gradiencie gęstości

-pozbawienie krwi fibrynogenu poprzez wytrząsanie z kulkami szklanymi

-rozcieńczenie krwi PBS (medium hodowlane) 1:1

-naniesienie rozcieńczonej krwi na gradient gęstości (GRADISOL-L, o gęstości, przy której limfocyty zatrzymuja się na granicy faz 1,077 g/ml)

-wirowanie 30' x 2000 obrerytrocyty i granulocyty przechodzą do gradientu i tworzą na dnie próbówki osad, natomiast limfocyty pozostają na granicy faz medium i gradientu, tworząc biały kożuszek

-pozbycie się komórek żernych przez dodanie opiłków żelaza (opadają)

-pobieranie komórek z interfazy

-płukanie komórek PBS 2 x 5' wirowanie

-barwienie przyżyciowe błękitem trypanu(niebieskie martwe, białe żywe)

-gradienty gęstości-polimery wielocukrów

r-r fikolu
GRADISOL-L

-cechy dobrego gradientu

określona względna gęstość(w miarę stała)
niska lepkość
substancje nietoksyczne, nie przenikające do komórek
łatwe do odpłukania
izoosmotyczne w stosunku do krwinek(280 miliosmomoli)

-zastosowanie:

izolacja limfocytów z pełnej krwi

metody adherencyjne

-adherencja-zdolność do przylegania do szkiełka lub plastiku

-przepuszczenie komórek żernych przez kolumnę wypełnioną :

szklanymi kulkami
watą nylonową
styrenem

-zastosowanie:

izolacja granulocytow
izolacja monocytów
izolacja makrofagów
izolacja limfocytów B( częściowo)

szok osmotyczny

-hemoliza erytrocytow

-dodanie 2 obj. wody detylowanej

2.Metody biologiczne

rozetowanie

-wykorzystanie faktu, że limfocyty T maja receptory dla erytrocytów innych gatunków zwierząt (np. receptor CD2 dla barana/owcy)

-tworzace się rozety można oddzielic na gradiencie gęstości od nie tworzących rozet limfocytów B

-powstałe rozety szybciej opadają na dno

-zastosowanie:

izolacja subpopulacji (limfocytów T)

metody immunoadsorbcyjne( panning, pokrywanie)

- nosniki sa opłaszczone przeciwciałami przeciw Ag na poszukiwanych komórkach układu immunologiznego, które łacza się z plastikiem niekowalencyjnie

-pokrycie płytki zawiesina komórek

-komórki posiadające określony antygen wiążą się z przeciwciałami na płytce

-komórki nie posiadające antygenu zostaja usunięte podczas odplukania

-komórki związane z plytka można odczepić przez zmiane warunków inkubacji lub poprzez trawienie enzymatyczne

-zastosowanie:

usuwanie określonej populacji komórek(pod wpływem związania z plytka komórki mogą być zmienione lub ulec aktywacji)
izolacja subpopulacji limfocytów

FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter) (sortujący cytometr przepływowy)

-próbkę krwi (ok. 100μl) podajemy do urządzenia

-zasysanie krwi

-reakcja antygenów komórkowych z przeciwciałami monoklonalnymi, znakowanymi fluorochromem(każde Ab znakowane innym)

-przepływ komórek przez wibrującą komorę przepływową cytometru

-opuszczający ją strumień tworzony przez badaną próbę i bufor oświetlany jest przez laser

-każda komórka jest oceniania pod względem

wielkości (rozproszenie przednie, ugięcie promienia w osi przebiegu)
stopnia ziarnistości(rozproszenie boczne pod kątem 90˚)
czerwonej fluorescencji
zielonej fluorescencji

-na skutek wibracji komory wypływający z niej strumień ma postać kropel

-można im nadać ładunek elektryczny , a następnie ukierunkować ich przebieg(sortować)

-sortowanie jest sterowane komputerowo i zbiera do osobnych probówek komórki

różniące się mierzonymi parametrami

-zastosowanie:

identyfikacja i sortowanie komórek, w oparciu o różnice w ekspresji powierzchniowych antygenów wykrywanych znakowanymi przeciwciałami
diagnostyka białaczek, chłoniaków, AIDS

Przeciwciała monoklonalne

-o określonej swoistości; przeciwko 1 determinancie antygenowej(rozpoznaja tylko 1 epitop)

otrzymywanie

-fuzja zawiesiny komórek śledziony myszy(zaszczepionej wcześniej antygenem) z komórkami szpiczaka po dodaniu PEG (glikolu polietylenowego),który sprzyja zlepianiu się blon komórek

-jedynie niewielka liczba komórek tworzy hybrydy

-mieszaninę komórek hoduje się w medium HAT

-komórki szpiczaka gina w HAT, a komórki śledziony przeżywają do1-2 tygodni w hodowli

-pozostałe hybrydy bada się na obecność oczekiwanych przeciwciał

-w przypadku wyniku pozytywnego hodowle te są klonowane przez przenoszenie komórek do nowych studzienek tak, aby w każdej znajdowała się pojedyncza komórka

-w efekcie uzyskuje się klony wywodzące się z pojedynczych komórek macierzystych

-hybrydoma są:

nieśmiertelne (dzięki szpiczakowi mnogiemu)
produkuja 1 rodzaj przeciwciał monoklonalnych (dzięki limfocytom B)

-metoda alternatywna ich otrzymywania jest transformacja limfocytów B

zastosowanie

-wysoce swoiste detektory

V. Metody immunomorfologiczne cz.I -identyfikacja subpopulacji limfocytów

Metody immunomorfologiczne

-określenie miejsca na powierzchni komórki., w którym dany antygen występuję za pomocą przeciwciał monoklonalnych

-ich rodzajem są metody immunofluorescencyjne i immunohistochemiczne

Cluster-zbiór leżących blisko siebie, podobnych antygenów

Metody immunofluorescencyjne(IF):

-metoda identyfikacji poszczególnych antygenów w tkankach lub na komórkach droga wiazania przeciwciała znakowanego fluorochromem

-pozwalają na wykrycie wielu antygenów uwzględniając ich rozłożenie w różnych komórkach lub ich przedziałach subkomórkowych na jednym szkiełku lub w zawiesinie

metoda bezpośrednia(DIF)

metoda pośrednia(IIF)

metoda dwuskładnikowa

etapy metody pośredniej:

-do zawiesiny limfocytów (ok. 100μl) dodajemy przeciwciała monoklonalne (ok. 20 μl)

-mieszanie pipeta pasterowska

-inkubacja 30' w temperaturze 4˚C

-płukanie w nadmiarze PBS i mieszanie

-wirowanie 5' x 1500 obr.

-usunięcie nadmiaru PBS

-dodanie przeciwciała poliklonalnego (50 μl) zinkubowanego z fluoresceina

RaM IgG /FITC

^1/8

^1/16

-inkubacja 20' w temperaturze 4˚C

-płukanie w nadmiarze PBS i mieszanie

-wirowanie 5' x 1500 obr.

-usunięcie nadmiaru PBS

-wykonanie preparatu -na szkiełko dajemy 1 krople PVA (alkoholu poliwinylowego)

- 1 kropla komórek

Fluorochromy:

FITC-izotiocjanian fluoresceiny, -zielony
TRITC-tetrametyloizotiocjanian fluoresceiny (izotiocjanian tetrametlrodaminy)-czerwony
PE-fikoerytryna, -pomarańczowy
chlorek dansylu

Fluorescencja:

-kropkowa

-pierścieniowa

-capping - w kształcie czapeczki-proces, drogą którego antygeny ulegaja agregacji na jednym biegunie komórki (limfocyty B)

Profil immunologiczny-odsetek zawartości populacji i subpopulacji komórek, określany dzieki antygenom różnicowania CD

Antygeny różnicowania:

CD2 -pan T(wszystkie limfocyty T)

CD4 -limfocyty T_H

CD8 -limfocyty T_C

CD22-limfocyty B

CD19

CD56-komórki NK

CD16

Prawidłowy profil immunologiczny

pan T (CD2) -72% ± 7%
T_H(CD4) -45% ± 10%
T_C (CD8) -28% ± 8%
pan B (CD22) -10%

(CD19)

NK (CD56) -20%

(CD16)

Prawidłowo powinno być 2 razy wiecej limfocytów pomocniczych niż cytotoksycznych

CD4

CD8 = 1,74 ± 0,2

poniżej 1 - AIDS

powyżej 3 - reakcje zapalne

VI. Ocena zdolności funkcjonalnej komórek układu odpornościowego

Ocena zdolności komórek do proliferacji

-proliferacja - szereg procesów metabolicznych prowadzących do zmiany wyglądu komórki wyjściowej do blastu (transformacja blastyczna)

-komórka odpowiada zmianą morfologii(zwiekszenie ilości cytoplazmy) i przejściem w formę aktywną na bodziec

limfocyty Tkomórki efektorowe

komórki pamieci

limfocyty Bplazmocyty

komórki pamieci

-proces transformacji blastycznej można odtworzyć in vitro przy pomocy substancji:

antygeny swoiste:

-oczyszczona tuberkulina

-anatoksyna tężcowa

-streptokinaza paciorkowcowa

-zawarte w ekstrakcie: Candida albicans, S. aureus, E. coli

-lektyny: PHA limfocyty T

Con A (konkawalina A)

PWM (mitogen szkarłatki) limfocyty T i B

antygeny nieswoiste:

-LPS

-bialko gronkowcowe A limfocyty B

-PMA (octan mirystynowy forbolu)

-ocena zdolności do transformacji

metoda izotopowa

-wyizolowane limfocyty umieszcza się w próbówkach zawierających antygen/mitogen i podłoże hodowlane

-na 16h przed zakończeniem hodowli dodaje się tymidyne znakowana trytem (³H- tymidyna)

-komorki zbiera się na wykonane z włókna szklanego filtry i mierzy się ich radioaktywność (emisję promieniowania β)

-pomiar włączonych nukleotydów tymidyny znakowanej trytem, wbudowujących się do DNA komórek proliferujących stymulowanych miogenem

-wysokie wartości pomiaru świadczą o tym iż w reakcji na mitogen komórki uległy transformacji

metoda nieizotopowa

-zastosowanie analogu BrdU(5'bromodeoksyurydyna) zamiast tymidyny

-przeciwciała przeciwko BrdU znakowane enzymem/fluorochromem

test mieszanej reakcji limfocytów(MLR-mixed limphocyte reaction)

-przy oznaczaniu zgodności miedzy biorcą i dawcą w transplantologii

-wykorzystuje zależność: jeżeli komórki różnia się antygenowo pod względem HLA to proliferują; jeżeli są zgodne tkankowo to nie proliferuja

-posiadamy pakiet wzorcowych limfocytów o określonej HLA

limfocyty T - HLA A,B,C

limfocyty B - HLA D

-podajemy biorcy znany limfocyt i obserwujemy czy nastapi proliferacja

-zastosowanie testów proliferacji:

diagnostyka pierwotnych niedoborów odporności
diagnostyka wtórnych niedoborów odporności

używanie leków immunosupresyjnych
niedożywienie
oparzenia
nagłe urazy/zabiegi chirurgiczne
choroby zakażne
choroby nowotworowe
choroby autoimmunologiczne
uzależnienia
HIV - monitorowanie nosicieli
Testy skórne - czynnościowa ocena wydolności komórek układu odpornościowego

-powstaje reakcja bąblowo-rumieniowa po podaniu alergenu

-na początku reakcji komórki tuczne wydzielają mediatory (histamina)

-pobudzonie zakończeń aksonalnych

-rozszerzenie naczyń krwionośnych zaczerwienienie

-wzrost przepuszczalności naczyń wynaczynienie białek osoczabąbel

-w próbie tuberkulinowej:<1,5 cm : norma

>1,5-2 cm : nadmierna choroba

Ocena produkcji cytokin

-miara aktywności komórek [zwłaszcza limfocytów T (T_H1, T_H2)]

-odpowiedz humoralna: Il-4,5,6,8,10,13

-odpowiedz komórkowa: Il-2,IFNγ

-nadmiar:

reumatoidalne zapalenie stawów (Il-1, TNFα)
choroba Crohna (Il-1, TNFα)
miażdżycowe zapalenie naczyń (Il-1, TNFα)

-osłabiona:

HIV (Il-2, TNFα)
toczeń układowy
choroby o podłożu alergicznym (nadmiar IgE Il-4,5,6,8,13)

-metody mierzenia cytokin:

FACS
przeciwciała monoklonalne, np. CD25, CD71,CD69
metoda ELISPOT(miejscowy,”punktowy” test immunoenzymatyczny)

-plytka opłaszczona przeciwciałem wiążącym cytokinę(np. anty- IFNγ)

-umieszczenie na płytce limfocytów

-wydzielana cytokina wiąże się z przeciwciałem w najbliższym otoczeniu komórki

- miejsca (spots)gdzie doszło do takiego wiązania można wykryc reakcja barwna przez dodanie sprzęgniętych z enzymem przeciwciał przeciwko cytokinie i chromogenu

Ocena cytotoksycznej funkcji komórek

-3 grupy komórek:

muszą być wstępnie uczulone
nie wymagają wstępnej immunizacji (np. NK)
biorą udział w cytotoksyczności zależnej od antygenu ADCC (mają na powierzchni receptory dla fragmentu Fc IgG)

-nadmierna :

możliwość odrzucenia przeszczepu
świadczy o ozdrowieniu chorego na nowotwór, po infekcjach

-osłabiona:

niedobory immunologiczne związane z zakażeniem wirusem HIV
inne choroby zakaźne
nowotwory

-metody oceny cytotoksyczności:

test izotopowy

-komórki docelowe inkubuje się z ⁵¹Cr, który wiaże się z ich bialkami

-wirowanie i odpłukanie wolnego ⁵¹Cr

-mieszanie ocenianych komórek komórek efektorowych i komórek docelowych

-wspólna hodowla przez 4-16h

-ocena cytotoksyczności(zdolności do lizy komórek docelowych) przez pomiar ilości uwolnionego z komórek docelowych chromu do nadsaczu

test MTT

-pochłanianie i redukcja odczynnika MTT

-spektrofotometry

Ocena zdolności do chemotaksji, fagocytozy i zabijania wewnątrzkomórkowego

a)ocena zdolności do chemotaksji

-chemotaksja - ukierunkowane przemieszczanie się komórek indukowane gradientem substancji chemicznej

-substancje chemotaktyczne = chemotaksyny

egzogenne

-pochodzenia bakteryjnego

-syntetyczne peptydy

-kazeina

endogenne

-produkty aktywacji dopełniacza C3a i C5a (osocze)

-fibrynogen

-czynniki płytkowe

-Il-2, Il-8

-leukotrieny

-obniżona:

fizjologicznie: u noworodków i niemowląt
zespoły niedoboru odporności

-metody badania chemotaksji:

mikroskopowe:obserwacja ruchu i rejestracja drogi jednym czasie
in vivo: skórę się sakryfikuje i przykłada szkiełko z czynnikami chemotaktycznymi, po pewnym czaie liczy się ilość i jakość komórek przylegających
in vitro: na agarze wycina się dołki i komory

b)ocena zdolności do fagocytozy

-fagocytoza - zdolność do pochłaniania i usuwania drobnoustrojów i antygenow

-komórki:

granulocyty
makrofagi

-ocenia się wobec bakterii, grzybów, czasteczek nieorganicznych(np.. lateks)

c)ocena zdolności do wewnątrzkomórkowego zabijania

-killing - ocena zdolności komórek żernych do zabijania

-metody:

biologiczne

- z zabitych nie wyrastają kolonie

izotopowe

- z zastosowaniem tymidyny znakowanej trytem

-niezfagocytowane bakterie wbudowują tymidynę

-pomiar emisji promieniowania

barwienia przyżyciowego

-barwienie fagocytów

-martwe bakterie w fagosomie świecą na czerwono

-żywe bakterie w fagosomie świecą na zielono

d)ocena wewnątrzkomórkowego metabolizmu fagocytów

test pochłaniania i redukcji błękitu nitrotetrazoliowego(NBT)

-ocenia zdolność do fagocytozy i zabijania wewnątrzkomórkowego

-fagocyty wytwarzaja wolne rodniki ponadtlenkowe

-zużywaja tlen(wybuch tlenowy), wzrasta ilość NADH, NADPH (wykazuja zdolność

redukcji NBT do formazonu)

-formazon jest nierozpuszczalny w wodzie i odkłada się w cytoplazmie w postaci

niebieskich złogów

-8-10% fagocytów wykazuje ta zdolność bez pobudzenia

-przy 2 x wzroście : zakaźenie, np. bakteryjne

-ujemny wynik:

wrodzona α-gammaglobulinemia
leczenie kortykosteroidami

do pełnej krwi dodać równa objętość wody destylowanej (5-10
mieszanie pipeta pasterowską
wirowanie 5' x1500 obr.
usunięcie nadsączu - do granulocytów dodajemy nadmiar PBS
2 x płukanie i wirowanie 5' x1500 obr.
usunięcie nadsączu - dodanie 0,1ml 4mM NBT
inkubacja 20-30' w 37˚C
przerwanie reakcji - dodać 1-2 krople 0,1M HCl
dodajemy nadmiar PBS
2 x płukanie i wirowanie 5' x1500 obr.
usuniecie nadsaczu
wykonanie preparatu-na szkiełko kropla krwi

ocena zdolności do wzbudzania chemiluminescencji
ocena zdolności do redukcji cytochromu

VII. Metody immunomorfologiczne cz.II - testy immunohistochemiczne

Metody immunohistochemiczne:

-należą do metod immunomorfologicznych

-technika mrożeniowa i parafinowa

-wykorzystuja często metody immunoenzymatyczne

Metody immunoenzymatyczne:

-w reakcji antygenu z przeciwciałem, jeden ze składników jest związany z enzymem

-odpowiedni substrat(chromogen) dla markera enzymu jest potrzebny do wykazania nie rozpuszczalnych lub rozpuszczalnych produktów w miejscu reakcji antygenu i Ab

-zastosowanie:

metody immunohistopatologiczne
metody do wykrywania krążących we krwi antygenów, przeciwciał, kompleksow immunologicznych
diagnostyka chorób zakaźnych i pasożytniczych

-wykorzystywane enzymy:

peroksydaza chrzanowa(HRP)
fosfataza alkaliczna (AP)
oksydaza glukozowa

-typy reakcji immunoenzymatycznych:

metoda bezpośrednia

-Ag reaguje z Ab, które jest już wyznakowane enzymem

-następnie na kompleks działa się odpowiednim substratem

-wady:

-mała czułość

metoda pośrednia

- Ag reaguje z Ab niczym nie oznakowanym

-dodanie przeciwciał znakowanych enzymem, które sa skierowane przeciwko globulinom pierwszego etapu

metoda kompleksu enzym-antyenzym

-Ag reaguje z pierwszymi(pierwotnymi) przeciwciałami

-do pierwotnych Ab przyłączaja się przeciwciała wiążące(wtórne)-monoklonalne

-z fragmentem Fab przeciwciał wtórnych reaguja rozpuszczalne kompleksy enzym-antyenzym

-pierwsze przeciwciała są surowicą (nieodpornosciowa)

-drugie przeciwciała są odpornościowymi przeciwciałami wobec przeciwciał pierwszych i przeciecial w kompleksie enzym-antyenzym

-kompleksy e-antye są tak przygotowane, że zawieraja 2 czasteczki przeciwciała i 3 cząsteczki enzymu

-rodzaje kompleksów:

PAP (peroksydaza-antyperoksydaza)
APAAP(fosfataza-antyfosfataza) - 2 czasteczki enzymu
GAG(oksydaza glukozowa - antyoksydaza glukozowa)

metoda ABC(awidyna-biotyna kompleks)

-przyłaczenie pierwszych przeciwciał do Ag

-dodanie przeciwciał znakowanych biotyną (biotynylowanych), będących antyglobulinami dla przeciwciał pierwszych

-przyłączenie kompleksów peroksydazy biotynylowanej z awidyna do biotyny wtórnych przeciwciał

-biotyna - może się az do 150 miejsc na Ig przyczepić, ma bardzo duże powinowactw do awidyny lub streptawidyny

-awidyna - glikoproteina białka jaja kurzego, ma 4 miejsca wiazania dla biotyny

EnVision

-Ag reaguje z Ab monoklonalnym

-w drugiej inkubacji dodaje się polimeru dekstranu z szeregiem drugich przeciwciał (20)

i enzymów (100)

-zalety metody:

+tania

+szybka (13 min)

+czuła

Metoda peroksydazowa

utrwalenie preparatu

-permeabilizacja-sztuczne zwiększenie przepuszczalności błony( ułatwienie penetracji przeciwciała do antygenu)

-utrwalacze:

formaldehyd(zbuforowany) - metoda parafinowa
aceton ,alkohole - metoda mrożeniowa
triton x
detergenty jonowe
odsłonięcie determinant antygenowych

-ponowne, bo utrwalacze często powoduja powstawanie krzyżowych wiazań z białkami-maskowanie antygenu

-odsłoniecie w technice parafinowej:

trawienie proteolityczne przed wykonaniem preparatu (trypsyna, chymotrypsyna, pepsyna)
gotowanie w buforze cytrynianowym o pH 6(w szybkowarze lub mikrofalówce)

hamowanie endogennej aktywności enzymów użytych do znakowania przeciwciał

-aby nie było fałszywych wyników

-enzymy:

HRP - w leukocytach, erytrocytach, makrofagach, komórkach nabłonka

- hamowana : kwasem nadjodowym

bromowodorkiem sodu

H₂0₂ w różnych stężeniach

AP - w komórkach nabłonka jelit, neutrofilach,

- hamowana : lewamizol

kwasem nadjodowym lub octowym

oksydaza glukozowa - pochodzenia bakteryjnego

- nie musi być hamowana bo brak jej w tkankach czlowieka

dodanie przeciwciała monoklonalnego wykrywającego określony antygen i inkubacja 60' w komorze wilgotnej w temp pokojowej pod przykryciem
odpłukanie nadmiaru przeciwciała TBS
wykrycie Ig mysiej (przeciwciała monoklonalnego) przy użyciu innej Ig (króliczej) znakowanej peroksydazą chrzanową
inkubacja 30' i płukanie 2 x 5' TBS
wykrycie aktywności enzymu znacznikowego

-barwny produkt w miejscu szukanej determinanty antygenowej

-substraty dla enzymów

HRP - DAB (3,3'-diaminobenzydyna) - ma powinowactwo do metali ciężkich

(nikiel,kobalt), daje brązowy produkt w wyniku utleniania,

nierozpuszczalny w rozpuszczalnikach organicznych(koniecznośc

zastosowania balsamu kanadyjskiego),

- CN (chlornaftol) - daje niebieski produkt

- AEK (aminoetylokarbazol) - daje czerwony produkt, rozpuszczalny w

alkoholu,

AP - pochodne naftolu (fast red, fast blue), zamykanie glicerożelem, bo

rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych

podbarwienie hematoksylina dla lepszej widoczności
zamkniecie balsamem kanadyjskim

VIII. Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych w klinice - markery tkankowe

Wystepowanie antygenów:

w cytoplazmie
w jadrze
na powierzchni komórki

1.Antygeny

CK 18 -cytokeratyna 18, pochodzenia nabłonkowego
keratyny - pochodzenia nabłonkowego
wimentyna - pochodzi z mezenchymy (jak komórko czerniaka,melanocyty)
desmina - w mięśniach gładkich, szkieletowych, sercowych
GFAP - kwasne białko filamentów glejowych
neurofilamenty - komórki nerwowe

Koekspresja filamentów pośrednich w nowotworach jest częsta:

wimentyna + keratyna rak nerek, płuc, sutka, jajnika
wimentyna + desmina mięsaki, guzy mieśniowe
wimentyna + keratyna + desmina komórki międzybłonka

Antygeny

EMA - przeciwciało różnicujące komórki pochodzenia nabłonkowego
LCA -(leucocite common antygen) z tkanki limfoidalnej (pochodzenie mezenchymalnego)
CD14 - okresowo swoisty epitop CAE (antygenu karcinoembrionalnego)
WEGF - antygen komórek śródbłonka
NSE - antygen komórek neuroendokrynnych
PSA - w gruczole krokowym lub krąży we krwi
TGB - tyreoglobulina - tarczyca
hCG - gonadotropina kosmówkowa
hPL - laktogen łożyskowy
kalcytonina - tarczyca

2.Antygeny w ocenie rokowania

Ocena frakcji proliferacyjnej

Ki67 - antygen określający wszystkie etapy cyklu komorkowego z wyjatkiem fazy G₀
PCNA - określa fazę S cyklu

Ocena inwazji (zdolności do rozprzestrzeniania się i dawania przerzutów)

CD44 - związany z adhezja komórek
nm 23 - związany z przerzutowaniem komórek nowotworowych

Produkty genów supresorowych

p53 - „strażnik genomu”, lokalizacja jadrowa, normalnie skierowuje uszkodzony materiał w fazie G₁ albo do naprawy albo na droge apaoptozy, nieprawidłowe ma przedłużony okres półtrwania

Produkty onkogenów