KONFORMACJE BIAŁEK- ASPEKTY MEDYCZNE

• białka- 20% masy całkowitej E.coli, 30% komórki ssaka

• macromolecal crowding- 20-30% V komórki zajmowane przez makrocząsteczki (200-300g/l)

• choroby związane z nieprawidłową str i agregacją białek:

• amyloidyzydozy → agregaty zewn kom

• zaćma → inaktywacja białek chaperonowych

• miopatia → inaktywacja białek chaperonowych

• mukowiscydoza

• Alzhaimer

• Parkinson

• Huntington

• stwardnienie zanikowe boczne

• choroby prionowe

• Aminokwasy- związki optycznie czynne (wyjątek Gly) białka zbudowane z L-aa (mieszanka utrudniała syntezę)- wyjątek → białka w ścianach bakterii

• białka tworzą różne struktury (determinowane kolejnością aa)

• wiązanie peptydowe jest płaskie, ponieważ dodatkowa para e^- w wiązaniu C=O może uczestniczyć w wiązaniu C-N

• rotacja możliwa wokół C-C (ale ograniczone przez zawadę sferyczną)

• konformacja łańcucha głównego zależy od wartości Ψ

• kąty torsyjne: Φ: N-C_α Ψ: C_α-C'

• ze względu na zawadę sferyczną możliwe tylko wybrane wartości Φ i Ψ dla danego aa → wykres Ramachandrana

• hydrofobowy rdzeń zawiera niepolarne reszty aa

• stabilizacja białek:

• wiązania wodorowe

• jonowe

• van der Wallsa

• hydrofobowe

• 3 poziomy organizacji str białek

• 1-rzędowa: sekwencja aa

• 2-rz. Fragmenty łańcucha polipeptydowego przyjmujące str α- helisę i β- kartkę

• 3-rz. Mówi o str całego łańcucha polipeptydowego

• 4-rz. Str zbudowana z więcej niż 1 łańcucha

struktura 2-rzędowa:

• helisa α- wiązania wodorowe powstają między atomem N i O łańcucha głównego należące do n i n+4 reszty aa, większość helis prawoskrętna

• harmonijka β- wiązania wodorowe powstają między różnymi fragmentami łańcucha peptydowego; antyrównoległa; równoległa- wiązania pod kątem do łańcucha; większość też prawoskrętna

• helisy i kartki połączone pętlami (loop):

• pętle, które łączą antyrównoległe łańcuchy β tworzą str szpilki do włosów

• zwroty β- krótkie szpilki do włosów

• motywy:

• helisa- zwrot- helisa (np. białka wiążące DNA, wiążące Ca²⁺, białka mięśni, kalmodulina C)

• szpilka do włosów → 2 łańcuchy β (pętla od 2- 5 reszt)

• klucz grecki → nukleaza Staphyllococcus, powstaje gdy podwójna str szpilki zagina się

• domeny: białka uczestniczące w koagulacji i fibrynolizie- łańcuchy polipeptydowe zorganizowane w domeny homologiczne do (EGF czynnik wzrostu naskórka) (proteinaz serynowych)

• α- a)struktura superhelisy (supercoil), dwie helisy α zwijają się wokół siebie, podstawowa str białek włóknistych (np. czynnik transkrypcyjny) stab. na 4 miejscu Leu, czyli hydrofobowe działanie Leu stabilizuje superhelisę; zamki leucynowe np. keratyna, stab też przez oddziaływania jonowe między g i e b) wiązanie 4 helis α c) pofałdowanie globinowe 8 helis α d) bardziej złożone np. muramidaza

• β- a) antyrównoległe β np. neuraminidaza wirusa grypy, 6 arkuszy po 4 łańcuchyβ (tetramer) b) helisy β- 1 skręt helisy tworzy 2 lub 3 łańcuchy β, w białkach bakteryjnych i wirusowych

• α/β- a) beczułka α/β (TIM barrel- nazwa od izomerazy tiofosforanowej) b) Rosman fold, struktura otwarta, w niektórych dhza-ach c) izomeraza fosforybozyloantranilowa, 2 baryłki α/β pod kątem 90st, uczestniczą w syntezie tryptofanu d) struktura podkowy e) OB fold, nukleaza Staphyllococcus, dom. W antykodonie w syntezie Asp-tRNA, podj β toksyn E. coli

struktura 4-rzędowa:

• np. białkowe płaszcze wirusów → tworzenie otoczki może zachodzić spontanicznie bez udziału innych białek

KOLAGEN

• skł tkanki łącznej- gotowanie→ żelatyna

• 27 typów kolagenu u ssaków (I- XXVII)

• białka tworzące włókna macierzy pozakomórkowej (tk łączna, skóra, ścięgna, chrząstki, kości, rogówka)

• ~30% całkowitej masy białek

• odp za utrzymywanie prawidłowej struktury tkanek, adhezję kom i chemotaksję

• helisę kolagenu tworzą 3 polipeptydy ( łańcuch α) z powtórzeniami Gly-X-X (najczęściej Pro i ProOH), łańcuchy są silnie zwinięte

• 42 różnych łańcuchów α

• 
  w zależności od rodzaju kolagen może zawierać identyczne lub różne łańcuchy np. α1(I)- łańcuch α1 (z 42) z cząstecz kolagenu typu I

• geny: np. COL 17A1 (łańcuch α1, kolagen typu XVII)

Synteza kolagenu:

• na ER szorstkim

• w formie prokolagenu

• modyfikacje potranslacyjne → przyłączanie cukrów, OH do Pro

• hydroksylacja proliny (wit C, szkorbut)

• 3 propeptydy równolegle, wiązanie wodorowe prokolagen zwijany od C do N

• prokolagen (aparat Golgiego) na zewnątrz kom (propeptydy usuwane), włokienka tworzą kolagen

• oksydaza lizylowa- w tworzeniu wiązań poprzecznych

• nie wszystkie typy tworzą włókna (włókna- I, II, III, V, IX...)

• czasem propeptydy zostają →inne formy

• helisa potrójna- unikalna- >20 białek z domenami kolagenu a)białka związane z odp immuno (C1q) b) acetylocholinosteroza (impulsy nerwowe) c)domeny niekolagenowe→ C - końcowe fragmenty kolagenu (inhibitory angiogenezy)

CLAC:

• collagen- like Alzheimer amyloid plaque component

• prekursorem CLAC jest CLAC-P → kolagen typu XXV

• potrójna helisa, typowa dla kolagenu, składnik płytek starczych (amyloid β w mózgu osób chorych)

Mutacje:

• >1300 mut, większość to zmiana zasady DNA →wymiana Gly (Gly jest mała, dzięki niej- ścisłe upakowanie) na inne aa →zaburzenia struktury potrójnej helisy (w miejscu tym koniec zwijania helisy, im bliżej C tym gorzej)

Choroby- mutacje:

• pęcherzykowe oddzielanie się naskórka (epidermolysis bullosa)- 2/100 tys urodzeń, pęcherze, syndaktylia blizny ukł oddechowego i przełyku, nie wszystkie formy EB są wynikiem mutacji

• wrodzona łamliwość kości (osteogenesis imperfecta)

• zespół Ehlersa- Danlosa

Kolagen jako biomateriał:

• skóra, ścięgno Achillesa bydlęce

• (+)- dostępny, ulega biodegradacji, właściwości hemostatyczne, nietoksyczny, formowalny, łączony z syntetycznymi polimerami

• (-)- niejednorodny, zanieczyszczenia, immunogenny, hydrofilny, ryzyko chorób prionowych

• włókna można uzyskać metodą elektrostatycznego przędzenia (electrospinning)- rozciąganie r-ru polimeru siłami pola elektrostatycznego, z kropli → nitka (do 1 m)

• wykorzystanie włókna- rusztowanie do hodowli tkanek- rekonstrukcja skóry, naczyń kości (inżynieria tkankowa); implant skóry: fibroblasty, keranocyty

• leczenie oparzeń- absorpcja płynu z uszkodzonych tkanek: właściwości hemostatyczne, nośnik czynnika wzrostu naskórka, antybiotyku

• gąbki, filmy, kapsułki- dozowanie leków, plazmidowe DNA (terapia genowa)

• rekonstrukcja tkanki kostnej na rusztowaniu:

• in vivo (szczur): gąbka kolagenowa +hBMP-2 (białka morfogenezy kości)(z E.coli, modyfikowane że domena łączy się z kolagenem; wszczepiono gąbkę w mięsień grzbietowy →cechy tkanki kostnej, (gąbka bez białka→resorpcja)

KERATYNA

• z grupy filamentów pośrednich

• białko fibrylarne- należy do rodziny filamentów pośrednich, posiadają α-helikalne domeny z pow. (po 7 reszt), które łatwo tworzą superhelisy

• cytoszkielet komórkowy: mikrotubule, filamenty aktyny, filamenty pośrednie: najbardziej trwałe elementy cytoszkieletu

• str filamentów pośrednich: 2 łańcuchy polipeptydowe → superhelisa → tetramer- 2 dimery, ale przesunięte wg siebie → włókna → filamenty pośrednie

• inne przykłady filamentów pośrednich- 6 typów: w I i II gr keratyna; w III GFA, desmina, wimentyna; w IV neurofilamenty

• w ludzkim genomie ~60 genów kodujących filamenty pośrednie

• filamenty stanowią ~1% całkowitej ilości białek

• w keranocytach naskórka i neuronach ok 85% białek

• filamenty pośrednie połączone z cytoszkieletem i bł kom

• przez desmosomy łączy się z keratynami innych komórek

• właściwości biomechaniczne keratyny (in vivo)- elastyczna, rozciągliwa, wytrzymała

Choroby związane z nieprawidłową str filamentów pośrednich: (www.interfil.org)

• NF-M - choroba Parkinsona

• NF-L - choroba Charcota- Marie- Tootha

• neurofialmenty- stwardnienie zanikowe boczne

• desmina- desminopatia serca

Mutacje najczęstsze w genach keratyny:

• Epidermolysis bullosa

• EBS z dystrofią mięśniową

• EBS z degradacją nerwów czuciowych

W inżynierii tkankowej:

• gąbki, filmy

FIBROINY

• są składnikiem jedwabiu produkowanego przez larwy jedwabnika morwowego

• serycyny okalają fibroiny

• fibroiny (spidroiny)- pająki (krzyżaki, złoty pająk jedwabny)

• właściwości mechaniczne jedwabiu- elastyczność, naprężenie, rozciągliwość, twardość, sprężystość

• nici pająka- super twarde, mocno rozciągliwe

• nić wiodąca: spidroina I- sekwencje poli-Ala (~8 monomerów) Gly- Gly- X (~10 powtórzeń); spidroina II- Gly- Pro- Gly- Gly- X, Gly- Pro- Gln- Gln

• 30% łańcuchów polipeptydowych pająków tworzy β-arkusze

• struktura nici jedwabnych: I sekwencje poli- Ala- tworzą arkusze β, które ulegają częściowej krystalizacji= twardość; I i II sekwencje Gly- Gly- X- nietypowe helisy= elastyczność

• pająk krzyżak- 7 rodzajów gruczołów → nici mają odmienne składy aa; skład aa zależy od diety pająka

• klonowanie i ekspresja cDNA kodujących fibroiny nici wiodącej w: kom E.coli, kom ssaczych, owadzich, transgeniczne larwy jedwabnika, zwierzęta transgeniczne

Otrzymywanie:

• włókna jedwabiu metodą elektrospinningu (słabo przypominają)

• włókna jedwabiu w 90% izopropanolu

• końce aminowe i COOH łańcucha ciężkiego fibroiny jedwabiu są silnie hydrofilowe

• fibroina w r-rze glikolu polietylowego → micele

• rozcieranie miceli → włókna

• fibroiny in vitro → różne struktury (nić, film, hydrożel) ale żadne niepodobne do pająka

• rekonstrukcja tkanki kostnej in vitro

• rekonstrukcja nerwów obwodowych (kom Schwanna są zdolne do opłaszczenia włókien jedwabiu i proliferacji); włókna z modyfikowanego jedwabiu umożliwiają wzrost kom nerwowych

*Potencjalne biomateriały:

• elastyna, aktyna, miozyna, fibrynogen, resilina (owady), tubulina, białka otoczki wirusa

• polimery białkowe z powt sekw → regularne str, samodzielne tworzenie nanowłókien (elastyna, fibroina, titina, keratyna, kolagen, białka nukleacyjne lodu, białka prionowe)

• białko SELP47K- samodzielnie tworzy nanofilamenty

KLEJENIE

• niektóre gat małż wytwarzają jedwabiste nici pełniące rolę kotwic (bisior)

• małż → b. elastyczne → b. włókniste → b. adhezyjne → skała

• białka → mfp (mussel foot protein)

• mfp3 i 5 → gł białka przyklejania omułków (zawierają pochodną Tyr- hydroksylacja pierścienia- 3,4- dihydroksyfenylo- L- alanina= DOPA)

• działanie DOPA- chelatowanie jonów metali obecnych na powierzchni skał (mogą też powstawać wiązania wodorowe)

• cell-Tak- 'klej'- ekstrakt białek adhezyjnych małży wykorzystywany do przyklejenia kom i tkanek do powierzchni szklanych, plastikowych, metalowych; stosowany w hybrydyzacji in situ

• nadprodukcja Mgfp-2 u E.coli- modyfikacja reszt Tyr do DOPA (tyrozynaza w obecności kw askorbinowego)

• gekony- keratynowe włoski na łapach (max prędkość >1 m/s; czas potrzebny do oderwania łapy od podłoża= 15ms)

• włoski- β- keratyna, w sposób hierarchiczny, 14 tys mikrowłosków na mm², tylko siły van der Vallsa!

• zdolność adhezji do podłoża zależy od sprężystości; pęczki keratynowych mikrowłosków (setae) wykazuje znacznie większą sprężystość niż sama keratyna

• Caulobacter crescentus- największa siła adhezji wśród org żywych (68N/ mm²; gekon 10N/ mm²)

BIAŁKA- MOTORY MOLEKULARNE

• przekształcenie energii chemicznej w mechaniczną

• białka motoryczne- poruszają się wzdłuż filamentów: transkrypcja, translacja, degradacja b., transport org, skurcz mięśni

• prędkość- 10- 700 nm/s

• siła hamująca- kilka pN (5-7 kN kinezyna; 25pN RNAP)

• procesywność- posuwanie się do końca pracy

• kinezyna, dyneina, miozyna- aktywny wewn kom transport cz. i organelli, wieloskładnikowe kompleksy wiążące i hydrolizujące ATP

• syntaza ATP- wykorzystuje ruch obrotowy jako mechaniczny katalizator, jedyna taka, poza wiciami i rzęskami

• kinezyna i dyneina porusza się wzdłuż mikrotubul, miozyna wzdłuż filamentów aktyny

• Mtoc- centrum aktywacji mikrotubul; dyneiny od centrum do zewn mikrotubul- do przodu; kinezyny odwrotnie- od tyłu w stronę jądra

• transport z udziałem kinezyn bardzo ważny, szczególnie w aksonach (transport ten = 1 minuta)

• mikrotubule, aktyna i filamenty pośrednie tworzą szkielet komórkowy

• filamenty pośrednie- usztywniają kom, chronią przed stresem mechanicznym

• mikrotubule- właściwa pozycja organelli w kom, transport wewn kom

• aktyna- nadaje kształt kom

• mikrotubule w rzęskach i wiciach- aksonemy

• cytoszkielet- struktura dynamiczna= „dynamiczna niestabilność”

• mikrotubule- cylindryczne polimery zbudowane z homologicznych podjednostek tubuliny α i β, β hydrolizuje GTP (α(-) β(+))

• filamenty aktyny- zbudowane z białek wiążących ADP

mikrotubule i filamenty aktyny ulegają ciągłemu skracaniu i wydłużaniu

• mikrotubule wiążą GTP: mikrotubula (dimer) → GTP → GDP → skracanie (bo odpadanie dimeru)

• jeśli na końcu dimeru GDP to rozpad, gdy czapeczka z GTP- str stabilna (można obserwować in vitro w mikroskopie elektronowym znakowane rodaminą)

• lek przeciwnowotworowy taksol- zakłóca podziały kom, wiążę się z mikrotubulami i stabilizuje f. spolaryzowane (naturalne źródło- cis)

Kinezyna konwencjonalna

• 45 rodzajów u ludzi

• motor na końcu C, N lub w środku

• typ N- porusza się wzdłuż mikrotubul →(+)

• typ C- porusza się wzdłuż mikrotubul →(-)

• typ M

• wiążą się z ER, AG, mitochondriami, endosomami i lizosomami

• ncd- kinezyna C porusza się w kierunku (-), we wrzecionie kinetycznym

Poruszanie- 3 modele:

• gąsienica- przesuwanie 1 głowy

• obrót o 180 st → noga do przodu (symetryczny model)

• niesymetryczne- helisa nieruchoma, a zmiany konformacji głowy

Doświadczenie potwierdzające model asymetryczny „wędrującej kinezyny”:

• mikrotubula nie obraca się

• w mikroskopie nie widać obrotów

• zmierzono długość „kroków” (znakowanie 1 głowy), odległość między znacznikiem- 16,6 mm, długość kroku 8nm

• więc model 4 prawidłowy= hand- over- hand

• związanie i hydroliza ATP powoduje zmiany konformacji i siłę wiązania kinezyny

• szyjka łącznikowa w obecności ATP wiążę się z domenami głowy; związanie ATP= wzrost powierzchni kinezyny

• przemieszczanie wzdłuż mikrotubul: kinezyna hydrolizuje 80 cz ATP/s x 8 nm= 640 nm/s; miozyna 8000 nm/s

• mutacja punktowa w ncd kodującym helisę (szyjkę) powoduje ruch kinezyny w obu kierunkach

Wiązanie ładunku do kinezyny:

• pęcherzyki transportowe mogą mieć specjalne białka dla wiązania z kinezyną

• lub specjalne tratwy

• jako ładunek mogą traktować też mikrotubule i filamenty aktyny

• w wiciach i rzęskach → kinezyny łączą aktyny z błonami kom

Nieprawidłowy transport wzdłuż mikrotubul → CHOROBY

• choroba Charcota- Marie- Tootha- typ 2a dziedziczona neuropatia czuciowo- ruchowa;

• mutacja missense w KIF1B → spada aktywność ATPazy i ruchliwość kinazy → nieprawidłowy transport mitochondriów w neuronach

• model zwierzęcy- myszy heterozygoty kif1B+/- = symptomy choroby; homozygoty kif1B-/- = śmierć

• choroba Alzheimera (AD)- w mózgu chorych: zewn kom- płytki starcze- amyloid β; wewn kom- zwyrodnienia neurofibrylarne (hiperfosforylowane białko tau)

• amyloid β z prekursorów amyloidów β (APP) wycinany z prekursora w yniku preseliny (kompleks b)

Dyneiny:

• aksonemy (wici i rzęski)

• cytoplazma: migracja jąder kom, separacja chromosomów w trakcie mitozy, transport org

• dyneiny należą do grupy białek AAA - ATPase associated with various activities

• hydroliza ATP → zmiany konformacji szyjki (modele: zmiany konformacji głowy, szyjki, łącznika)

• dyneinę tworzą: łańcuch ciężki i b dodatkowe (łańcuchy lekkie i średniolekkie)

Nieprawidłowe działanie dynein → CHOROBY

• choroba neuronu ruchowego (w tym stwardnienie zanikowe boczne)- mutacje w genach dyneiny

• choroba Huntingtona- zaburzenia koordynacji, ruchy mimowolne; mutacje w genie huntingtoniny (Htt) → zaburzenia transportu BDNT

• Htt wiążę podj dynaktyny p¹⁵⁰ i uczestniczy w transporcie BDNT (neurotrofiny) → prawidłowy rozwój synaptyczny, wzrost i różnicowanie neuronów

• w rzęskach i wiciach dyneina wiąże mikrotubule zorganizowane wg wzoru 9+2 (dyneina 3 motory w wiciach)

• ruch dyneiny= wyginanie się wici

• pierwotna dyskineza rzęskowa- przewlekłe nawracające zapalenie zatok i oskrzeli, ucha śr

• zespół Kartagenera- przewlekłe zapalenie zatok nosowych i oskrzeli (zespół odwróconych trzewi 50%)

• wirus polio i HSV₁ (opryszczka) wykorzystuje dyneinę w trakcie transportu do jądra kom.

• w zainfekowanym neuronie nukleokapsyd HSV porusza się za pomocą kinezyn

MIOZYNY

ogólna str podobna do dynein i kinezyn

• poruszają się wzdłuż wł aktynowych

• 18 klas

• miozyna typu I i II wraz z filamentami aktyny odpowiedzialne za skurcze mięśni szkieletowych i serca

w typie I:

• przeważają a-helisy

• łańcuchy lekkie usztywniają superhelisę

MODEL ŚLIZGOWY FILAMENTU:

• aktyna otacza filament z 2 stron w czasie skurczu

• zw i hydroliza ATP powoduje zmianę konformacji głowy miozyny

(ADP-VO3- -analog atp, nie ulega hydrolizie)

RUCH MIOZYNY WZDŁUŻ AKTYNY:

• w trakcie hyrdolizy wzrasta powierzchnia miozyny do aktyny

• gdy tylko ADP ramię dźwigni przesuwa się w 2 stronę

• tu 2 głowy działają jakby niezależnie

• miozyny dłużej związane

MIOZYNA V :

uczestniczy w transporcie białek, pęcherzyków w kom innych niż miofibryle

potrzebna do rozwoju melanocytów

też w uchu środkowym

CHOROBY WYWOŁYWANE NIEPRAWIDŁOWĄ STRUKTURĄ LUB DZIAŁANIEM MIOZYNY:

1. kardiomiopatia hipertroficzna- powiększenie serca, nagła śmierć, mutacje w MYH7- kodujący łańcuch ciężki B-miozyny

2. Myo5A (miozyna 5)- powoduje chorobę Griscellego, hipopigmentacja, uszkodzenie ukł nerwowego

3. Myo9B- celiakia- nietolerancja glutenu

4. MyoVIIA- syndrom Ushera (typ I)- zaburzenia słuchu i uszkodzenia wzroku (barwnikowe zwyrodnienie siatkówki)

MIOZYNA A SŁUCH:

w uchu środkowym- kom włoskowate- wyspecjalizowane neurony wewn ślimaka, posiadają wypustki. Stereocilia- w chorobie nie są one uporządkowane

MIOZYNA A WZROK:

słabo widoczne naczynia krwionośne w oku. Miozyna 7a w kom pręcikowych siatkówki

SYNDROM USHERA- TERAPIA GENOWA:

lentowirusy jako wektory- cDNA MYO7A do hodowli mysich kom nabłonka barwnikowego siatkówki (mut. Myo7a)-> prawidłowy fenotyp

SYNTAZA ATP (napędzana ruchem H+):

• cz. zintegrowana z bł F0 F₀: a₁b₂c_10-14

• podjednostka kat B (alfa ma podobną str ale nie hydrolizuje) Gamma wpycha się w heksamer, spadek c Mg2+ można sprawić oddysocjowanie F1

• cz syntazy ATP F1/εF0C10-14 obraca się względem pozostałych podjednostek

• przepływ protonów przez F0 powoduje obrót F0 i podj γεF1. Rotacja polipeptydu gamma zmienia str podj beta umożliwiając syntezę ATP

• hydroliza ATP w F1 indukuje rotację gamma i F0 w odwrotnym kierunku co umożliwia pompowanie H+

• podj gamma przechodzi prze heksamer (3 alfa i 3 beta) obracając się zmienia konformację podj beta

• każda podj beta (kazda w innej konf) po syntezie ATP uwalniany jest z podj beta znajdującej się w konf otwartej

WYKRYCIE RUCHU:

sondy umożliwiające śledzenie rotacji podj gamma znakowanie- filament aktyny znakowany flourescencyjnie

MECHANIZM NAPĘDZAJĄCY OBRÓT SYNTAZY:

w jaki sposób przepływ H+ przez F0 napędza syntazę?:

• podj alfa- w niej 2 kanały o charakterze hydrof? Od strony matrix i mitoch

• podj c reszty kw asparaginowego (musi być niezjonizowana gdy kontaktuje się z bł)

• gdy c kontaktuje się z kanałem → jonizacja

• gdy wchodzi H+ to jednostka musi się przesunąć by podj niezjonizowana mogła łączyć się z kanałem i ponowna jonizacja

obrót pierścienia 360 st to synteza 3 cząstek ATP

PODJEDNOSTKA ε- INHIBITOR SYNTAZY ATP:

zmiana ułożenia alfa-helisy podj ε → oddziaływuje między zasadowymi resztami helisy i resztami kwasowymi DELSEED podj B blokując rotację

synteza ATP może być wykorzystana do konstruowania nanomotorów

E niezbędna do obrotu o 120st

sztuczne org mogą produkować ATP niezbędny do napędzania nanomotoru- synt ATP

bakteriorodopsyna pod wpływem światła promuje protony do wnętrza proteopolimersomu, który powstał z polimeru przypominającego 2-warstwy lipidowe

Bakteriorodopsyna (7 helis alfa) działa jak pompa H+ wewn cz retinalu

retinal może być w konf całkowicie trans

retinal wiąże się z bakteriorodopsyną

retina zmienia konformacje pod wpływem UV co uwalnia proton → zmienia to konf białka i pompowany jest H+

Motory pakujące DNA do prokapsydów bakteriofagów T4, T5, T7, lambda, fag 21, SPP1 herpes, cytomegalii

najlepiej poznany phi 29 (B. subtilis) 1cz ATP- 2, 2,5 par DNA

siła hamująca- 57pN kinezyna- 7pN RNAP- 25pN 100pz/sek

w skład motoru wchodzi 6 nici RNA i ATPaza gp16 tworząca pierścień GP16 w. ATP

mechanizm pakowania z udziałem pRNA/gp16

wkręcanie:

• pchanie

• wciąganie

• przekładanie zęba

przy użyciu nanomagnesowych kulek można obserwować pakowanie DNA

motor phi 29 pakujący DNA można złożyć in vitro i umieścić w bł liposomu lub płytkach → potencjalne zastosowanie w terapii genowej

(WIEDZIEĆ: str, budowa synt ATP- które ruchome, choroby)

syntaza ATP- budowa:

F₀:

• hydrofobowa, w wew bł mitoch

• ma kanał protonowy z c_10-14

• do c przylega a

F₁:

• wystaje z bł w kierunku matrix

• α₃ β₃ γ δ ε

• α β ułożone naprzemiennie

• β- kat.

• γ wnika do α₃ β₃

połączone przez:

• trzonek γ ε

• a wewn kolumnę z 2a 2b i δ

to co się rusza to pierścień c i trzonek γ ε

FAŁDOWANIE BIAŁEK

Paradoks Levinthala (każda reszta aminokwasowi może przyjąć 3 różne konformacje: alfa, beta i gamma, zmiana konformacji trwa pikosekundę.

Rotacja jest możliwa wokół wiązania Cα- C' (kąt psi) i Cα-N (ϕ) Konformacja zależy od obu kątów. Ze względu na zawadę przestrzenną możliwe są tylko określone wartości kątów wykres Ramachandrana.

Polipeptyd zawierający 150 aa może przyjąć 3¹⁵⁰ = 10 ⁶⁸ konformacji. Czas potrzebny na znalezienie prawidłowej konformacji wyniósłby zatem 10⁴⁸ lat.

Jednak czas fałdowania In vivo i In vitro to 0,1-1000s (Paradoks Levinthala)

Fałdowanie nie jest przypadkowe. W trakcie fałdowania zachowane zostają częściowo prawidłowe struktury produktów pośrednich (zasada doboru kumulatywnego)

Sekwencja aa białka określa jego strukturę przestrzenną.

Ch. Anfinsen) badał rybonukleazę bydlęcą denaturując białko mocznikiem, B-merkaptoetanolem, chlorowodorkiem guanidyny.

W obecności B-merkaptoetanolu i 8M mocznika zredukowana rybonukleaza traci aktywność i przyjmuje konformację statystycznego kłębka.

Usunięcie B-merkaptoetanolu i mocznika przez dializę powoduje przywrócenie aktywności enzymu (tlen z pow. Utlenia gr. Hydroksysulfonowe)

Sekwencja aa zawiera informację determinującą kinetycznie aktywną domenę enzymu.

Utlenienie rybonukleazy w obecności 8M mocznika prowadzi do powstania nieaktywnego enzymu (obecne nieprawidłowe mostki S-S) po usunięciu mocznika i dodaniu B-merkaptoetanolu w niewielkiej ilości tworzą się nowe prawidłowe mostki.

Modele fałdowania białek :

1. skurcz hydrofobowy (gr. Hydroksylowe do środka, struktury α i β, tworzy się molten globule- rozluźniona globuła, będąca str. Pośrednią podczas fałdowani, składająca się w większości z str. 2rz i będąca mniej zwartą niż str. Natywne.)

2. nucleation growth (fałdowanie od konkretnego aa)

3. freamwork model

4. jigsaw model (łańcuchy mogą formować się w różny sposób)

HIPOTEZA LEJKA białka zwijając się zmniejszają swoją energię. Agregatom białkowym trudno pokonać barierę energetyczną.

Polipeptydy białkowe podatne na agregację:

1. W trakcie translacji nowosyntetyzowane polipeptydy eksponują miejsca hydrofobowe

2. długi wąski kanał w rybosomie

3. Nowosyntetyzowane polipeptydy narażone na agregacje.

Polisomy- w trakcie translacji rybosomy ściśnięte 1koło2

Fałdowanie białek w komórkach zachodzi z udziałem białek opiekuńczych i izomeraz:

1. Izomerazy dwusiarczkowe białek (PDI)

2. Izomerazy peptydyloprolinowe (PPI)

PDI - katalizują tworzenie wiązań S-S w wyniku utleniania 2 reszt CYS, u Eukaryota większość PDI znajduje się w ER, mniej w mitochondriach, u Prokaryota znajdują się w przestrzeni periplazmatycznej.

BPTI- inhibitor trypsyny trzustkowej, powstanie konformacji natywnej zachodzi poprzez formowanie intermediatów z natywnych mostków S-S.

W tworzeniu mostków S-S u bakterii uczestniczą białka Dsb A,B,C,D

Dsb C kat. rozpad niepoprawnych S-S i tworzenie natywnych

Gdy substrat utleniony to Dsb A zredukowane. Dsb B utlenia Dsb A (wtedy Dsb B ulega redukcji) elektron dalej przekazywany na ubichinon, cytochrom b i tlen.

Dsb mają motyw CYS-X-X- CYS

Dsb C:

- zrywanie mostków form zredukowanych

- ponowna redukcja Dsb C za pomocą Dsb D które działaztioredoksyną i NADPH

Brak prawidłowych mostków S-S nieprawidłowa strukturadegradacja

Bakterie patogenne produkują czynnik wirulencji (toksyny i fimbrie), które wymagają Dsb w trakcie fałdowania. Brak Dsb to brak patogenności.

W ER eukaryotów 1/3 wszystkich białek ulega modyfikacjom.Białka transportowane są do przedziałów kom.

Powstanie mostków S-S w ER (PDI) (mechanizm rekacji kat. Przez białkazawierające domeny CYS-X-X-CYS)

Białka z rodziny PDI > 10 ludzkich białek, 0,8% wszystkich białek.

PDI- oksydaza, reduktaza, izomeraza, i białko opiekuńcze.

STRUKTURA PDI

- domena tioredoksyny, niski stopień homologii sekw. Aa

- helisa α kieruje do ER

Białka PDI, Dsb, tioredoksyna, transferaza glutationu zawierają domeny tioredoksyny.

PPI- wiele z nich wiąże leki immunosupresyjne (hamuje odwracalnie aktywację lim. T)

Forma cis jest 1000 razy mniej stabilna niż trans. Jeżeli resztą R2 jest PRO wiązanie cis jest tylko 4 razy mniej stabilne niż trans.

Nazwa rodziny	Pochodzenie nazwy
Cyklofiliny FKBP Parwuliny FCBP	Wiążą cyklosporynę A FK506BP w FK506 Łac. Bardzo małe Wiążą FK506 i cyklosporynę A

Immunofiliny to : cyklofiliny, FKBP, FCBP

Cyklofilina (18 kDa) pierwsze białko zidentyfikowane jako cyklosporyna z grzyba tolypocladium

Ramycyna (Streptomyces hygroscopicus)

FK506 (s. tsukubaesis)

Hamowanie aktywacji lim T przez CsA i FK506:

- kluczowa rola : jądrowy czynnik aktywacji lim T, który musi ulec defosforylacji

- gdy w komórce cyklofilina To tworzy się kompleks z kalcyneuryną.

Funkcja FKBP wykracza poza typową rolę PPI:

- bierze udział w przekazywaniu sygnałów

- tworzą kompleksy z receptorami hormonów steroidowych

-transkrypcja

-transport białek i kompleksów wewnątrzkomórkowych (za pomocą białek motorycznych)

-regulują działanie IP3 odpowiadających za wiązanie wapnia w ER

FK506 i inne inhibitory PPI mogą być stosowane w leczeniu chorób neurologicznych.

Poziom FKBP jest wyższy w mózgu niż w innych tkanach.

DOŚWIADCZENIE

Prowadzone na nerwie kulszowym myszy.

FK506 przyspiesza regenerację uszkodzonych nerwów większości aksonów i grubość osłon mielinowych. Związanie FK506 przez FKBP52 symuluje elongacje aksonów w neuronach.

STRUKTURA FKBP52

-1 domena łączy FK506

-druga wiąże kalmodulinę

-i domena wiążąca Hsp 90.

FUNKCJA FKBP52- wiąże sekwencje D pojedynczej nici, genomowy AAV zapobiega syntezie 2 nici, dostarcza kompleksy zawierające receptory hormonów.

Ludzka cyklofilina A (CYPA)

-wiąże fragmenty Gog HIV-1 sekw. ALA-GLY-PRO-ILE

- wiąże GLY-PRO w konformacji trans

- pełni funcje chaperonu w trakcie tworzenia otoczki HIV

Parwulina PIN1 może hamować powstanie amyloidu Beta

Białka szoku termicznego Hsp

BIAŁKA OPIEKUŃCZE:

- fałdowanie nowosyntetyzowanych białek

-import białek do organelli

- degradacja białek niestabilnych

RODZINY Hsp	struktura	ATP	E.coli
Hsp 100 Hsp 90 Hsp 70	Heksametr Dimer monomer	+ + +	Clip A/Clip B HtpG DnaK/DnaJ,DnaK

Białka opiekuńcze uczestniczą w fałdowaniu nowo-syntetyzowanych polipeptydów

Hsp70 i Dna K podobna str. I funkcja

Białka bakteryjne:

a)Dna K (Hsp 70)

b) Dna J (Hsp 40)

c) Grp E

d) Gro EL (Hsp60)

e) Gro ES (Hsp 10)

f) TF

białka Archea

a)PFD- prefoldyna

b)NAC- kompleks związany z nowo syntetyzowanym łańcuchem polipeptydowym

c) DnaK

d) Dna J

e) termosom (Hsp 90)

Eukaryota- tu tylko NAC i RAC (białka związane z rybosomom) i niektóre białka NEFs (nucleotid exchange factor)

Białka nieodwracalnie uszkodzone są degradowane przez proteazy

BAKTERYJNY TF

- pętle L4 i L22 rybosomu umożliwiają tworzenie str. 2rz

-budowa: 3 części głowa, tułów ogon

-wiąże się on do dużej podjednostki rybosomy w pobliżu miejsca wyjścia polipeptydu.

- powierzchnia TF skierowana w stronę peptydu ma charakter hydrofobowy

U drożdży i ssaków w fałdowaniu polipeptydów uczestniczy szereg białek związanych z rybosomom.

Bakteryjne białka nie związane z rybosomom:

Hsp 70 i Hsp 40 wiążą hydrofobowy fragment łańcuchów polipeptydowych

Hsp70 ma 2 domeny wiążące substrat (w formie str. Beta) (DnaK, HscA, HscC)

Z synt. Białek u bakterii Hsp 70 współpracuje Clp (Hsp 100) o Shop (funkcja ważna w warunkach stresowych)

Refałdowanie przez Clp/Hsp100 : potrafia one zrefałdować peptyd lub go rozwinąć

Udział Hsp 104 w namnażaniu prionó gdy go nie ma priony nie powstają, gdy nadmiar priony też nie powstają bo rozbity nadmiar fibryli.

Rola Clp/Hsp100 i systemu Hsp70/DnaK

sHsps:

- małe białka szoku termicznego

-masa cząsteczkowa 14000-35000

- digeometryczna str.

- domena alfa- krystality

Krystality αA i αB to białka opiekuńcze w oku ssaka.

(Hsp 60) Gro EL tworzy dwa pierścienie po 7 podjednostek wiążące ATP.

Gro ES wiąże się z jednym z pierścieni Gro EL ( z pierścieniem cis) i zmienia strukturę tego pierścienia.

Fałdowanie wewnątrz pierścienia Gro EL;

-substrat odizolowany od środowiska (bierny udział Gro EL)

- hydrofilne reszty wewnętrzne Gro EL wymuszają chowanie reszt hydrofobowych do środka

Substrat związany przez kilka hydrofobowych miejsc pierścienia Gro EL zostaje rozfałdowany w wyniku przyłączenia ATP i Gro ES

FAŁDOWANIE BIAŁEK W ER

W Fałdowanu poza chaperonami niezbędne:

- PDI, PPI, białka uczestniczące w glikozylacji polipeptydów Asn, kalneksyna/kalretikulina

Sekwencja sygnałowa na końcu N' białka:

- 13-36 aa

- przynajmniej jedna cz. Z ładunkiem +

-sekwencja sygnałowa niezbędna do dostania się do ER

Glikoproteinyoligosacharyd pełni rolę adresu kierującego białka w odpowiednie miejsce.

Kompleks transferaz oligosacharydu przenosi elektron (Glc)3—Mang- (GlcNAC)2-- GLc Noc z fosforanu na łańcuch boczny ASP nowo- synt. Białka

ER	Kalneksyna/kalretikulina
Struktury pośrednie ER-AG Pęcherzyki transportowe	ERGi 53 VIP 36

Kalneksyny związane z błoną ER rozpoznają oligosacharyd a właściwie jedną glukozę na końcu N

UGGT- glukozylotransferaz UDP-glukozy (gdy białka źłe sfałdowane to ponownie przyłącza glukozę do białka)

GlcII- glUkozydaza

ManI - mannozydaza

ERp57 - izomeraza dwusiarczkowi

Hsp47

- niezbędny w produkcji kolagenu na etapie prze hydrolizą proliny, jest to białko nadprodukowane w narządach (płuca, serce, wątroba) i skórę w których zachodzi nieprawidłowe włóknienie (fibrotic disease np. włóknienie płuc )

Mut. W genie SERPINH1 powoduje wrodzoną łamliwość kości,

- autoantygen w chorobach reumatologicznych

-biomarker guzów nowotworowych

TAPAZYNA (Tap associated glycoprotein) - białko transbłonowe (48 kDa) w ER uczestniczy w składniu białek MHC kl. I z peptydem.

ROLA BIALEK SZOKU TERMICZNEGO w regulacji apoptozy i w procesie ontogenezy

Termotolerancja- kom. są mniej podatne na szok termiczny jeżeli wcześniej zostały poddane działaniu umiarkowanie podwyższonej temp. Kom. wykazujące termotolerancję mają wyższy poziom Hsp. Hsp hamują apoptozę i powodują odporność fizyko-chem. Kom.

Nekroza apoptoza

-śmierć kom - programowana śmierć kom

Różnicowanie i onkogeneza

Usuwanie kom. nieprawidłowych, błędnie

Umiejscowionych, uszkodzonych

- naturalne kom. cytotoksyczne rozpoznają

Fragmenty wirusów na pow. Kom.-apoptoza

Kom. zarażonych wirusem

- apoptoza niedojrzałych lim. B połączonych z

Antygenem.

Apoptoza uruchamiana przez kaskady Kaspaz (kaspazy-proteazy cysternowe rozpoznające motywy z resztą Asp, syntetyzowane w formie nieaktywnych zymogenów.

Szlak mitochondrialny:

Bax i Bak uwalniają cytochrom c, który łączy się z Apaf 1 do niego dochodzi Kaspara 9 tworzy się apoptosom aktywujący Inne kaspazy.

Szlak zewnętrzny:

- receptory śmierci mają domeny rozpoznawane prze prokaspazę 8, która zostaje zaktywowanaaktywacja kaspazy 3 degradacja cytoszkieletu.

Hsp hamuje różne etapy apoptozy:

Dośw.

Αβkrystalina (sHsp) hamuje kaspazę 3

Hsp 70 hamuje apoptozę przez wiązanie Apaf 1 nieaktywna Kaspara 9 -bark aktywacji kaspazy 3

sHsp hamuje:

- kompleks Apaf1 i cytochrom c

-aktywacja pokaspazy 9

-powstanie reaktywnych form tlenu.

Komórki nowotworowe często mają podwyższoną ilość Hsp (Hsp90, Hsp70, Hsp27)

Hsp niezbędna do rozwoju niektórych nowotworów

1.Hsp mogą powodować odporność na leki

2.Aktywacja nabytej odp.

Hsp wiążą peptydy pochodzące z kom nowotworowych. Kompleksy te rozpoznawane są przez kom. prezentujące antygenaktywacja odp. immunologicznej lim T rozpoznają kom nowotworowe

3. Aktywacja wrodzonej odp.

Hsp- APCcyt .CD40,TNFalfa, IL1B, IL6, MHCII, NO

Hamowanie ekspresji Hsp 70 przez siRNA lub antysensowny DNA:

- hamowanie rozwoju nowotworów

-wzrost wrażliwości kom nowotworowych na lek

-hamowanie odp. immunologicznej skierowanej przeciwko białkom nowotworowym

Zahamowanie ekspresji Hsp27 (antysensowny DNA powoduje wzrost wrażliwości kom. szpicaka na deksametrazon)

O procesach apoptotycznych świadczy degradacja PARD

BIAŁKA OPIEKUŃCZE Hsp90- cel leków antynowotworowych

dimer (kształt szczypiec, zamknięte gdy ATP)

nie działa sam → kompleks

oddziałuje z 70, 40 , Hip, Hop, co- chaperony, ← np. p 23 stabilizuje Hsp90

immunofilina (CYP40)→?

Hsp90 tworzy złożone kompleksy z subst (np. receptory estrogenów) i innymi białkami opiekuńczymi

geldanamycyna i radicicol (monorden) są inhibitorami kompetycyjnymi Hsp90- hamują proliferację kom nowotworowych

geldanamycyna- hamuje powstawanie dojrzałego kompleksu Hsp 90 z pozostałymi białkami (gł p 23)

lek antynowotworowy- analog geldanamycyny - 17 AAG

inhibicja:

proces onkogenezy wymaga wielu białek (kinaz, receptorów hormonów i czynników transkrypcji)

geldanamycyna nie działa na zdrowe kom. (bo kom nowotworowe mają wyższe powinowactwo do antybiotyku→100x silniejsze)

Hsp 90 w kom nowotworowych tworzy kompleksy inne niż w kom zdrowych (wyższa aktywność ATPazy)

kompleks Hsp 90 oddziałuje z p53- supresor guzów nowotworowych; p53 hamuje cykl kom, indukuje apoptozę i starzenie się kom.

~50% nowotworów→ mutacje w genie kodującym p53

Zespół Li-Fraumeni- dziedziczna, autosomalna dominująca, predyspozycja do rozwoju nowotworów mózgu, piersi i in, powodowana mutacjami w genach TP53 (kodujących p54 i CHEK2); ok 400 urodzeń, ryzyko wzrasta po 45 r.ż.

Hsp 90- bufor maskujący cechy morfogenetyczne (mutacja u D.melanogaster lub wpływ geldanamycyny

PROTEOLIZA

• degradacja białek regulatorowych

• usuwanie nieodwracalne uszkodzonych białek

Fragmenty hydrofobowe białek (wyeksponowane w trakcie syntezy lub w wyniku denaturacji i nieprawidłowego fałdowanie) są wiązane prze białka opiekuńcze i proteazy (triage)

Proteazy zależne od ATP (procaryota- ClpAP, ClpP, Lon) (eucaryota- proteasom 26s) usuwają nieodwracalnie uszkodzone białka

Naznaczanie białek procaryotycznych syntetyzowanych na uszkodzonym mRNA, nie zawierającym kodonu terminacyjnego

ssRNA- matryca umożliwiająca translację, pomimo braku kodonu STOP

Proteasom 26S:

• degradacja białek znakowanych ubikwityną

• kontrola cyklu kom, różnicowanie i apoptoza, prezentacja antygenu

• 20S- część proteolityczna, 19S- regulatorowa

• produkty trawienia białek przez proteasom posiadają od 3 do 25 reszt aa

• przyłączane enzymy E1, E2, E3

Zespół Angelmana:

• mutacja w genie kodującym ligazę HECT (UBE3A)

• 1/10-40 tys urodzeń

• 75% przypadków odmiany rodzinnej → mutacje w ww. Genie

zaburzenie ubikwitynacji i degradacji białek → Parkinson, Huntington, Alzheimer

Bortezamid (PS341)- hamuje aktywność proteasomu 26S → degradacja białek aktywujących apoptozę p53, p21 i inhibitora NF_кB

CHROBY KONFORMACYJNE/ AGREGACYJNE

• nieprawidłowe fałdowanie i agregacja

• przyczyną może być brak białek opiekuńczych

• pozakomórkowa agregacja białek → >30 różnych rodzajów amyloidoz

• wewnątrzkomórkowa agregacja → Parkinson (α- synukleina) , Huntington (huntingtyna), stwardnienie zanikowe boczne (dysmutaza ponadtlenkowa), Alzheimer (białko tau- hiperfosforylowane, amyloid agreguje pozakomórkowo)

• nieprawidłowo zwinięty polipeptyd → ulega degradacji przez proteasom → choroba- wynikiem braku aktywności białka

CF (cystic fibrosis):

• CFTR (brak aktywności a nie agregacji)

• autosomalna recesywna

• nierawidłowe funkcjonowanie transportu jonów

• objawy (gł oddechowy i pokarmowy)

CFTR:

• cystic fibrosis transmembrane regulator

• glikoproteina 170 kD, rodzina białek ABC (ATP binding cassette)

• funkcja kanału Cl^-

• reguluje sekrecję Cl^- przez inne kanały

• reguluje inne kanały (np. HCO₃^-)

• stymulowane przez amp aktywność kinazy

• transport glutationu

• wystepuje tam gdzie objawy

• uszkodzenie CFTR- brak aktywności, zaburzenia równowagi jonowej, transport Na⁺ przez EnaC → wymusza transport wody do komórki (ciśnienie osmotyczne)

• ENaC- epithelium Na channel

• >1500 mutacji w CFTR

• 70% to ΔF508 (chr 7)- delecja fenyloalaniny w pozycji 508 (zmiana ramki odczytu)

• 100% CFTR ΔF508- w wyniku nieprawidłowego fałdowania w ER zostaje przetransportowane do cytozolu → degradacja (mają trochę aktywności kanału Cl ale nie są transportowane do błony)

• 75% CFTR wt jest degradowane

• w fałdowaniu CFTR uczestniczą białka opiekuńcze: Hsp90, Hsp70, kalneksyna (lektyna); poziom białek opiekuńczych decyduje o tym jak org radzi sobie ze zmutowanym białkiem

5 klas mutacji CFTR:

1. nonsens/ przesunięcie ramki odczytu

2. nieprawidłowa modyfikacja i transport (np. ΔF508)

3. nieaktywne jako kanały Cl^-, nie reaguje na ATP

4. nieprawidłowa przepuszczalność Cl^-

5. zahamowanie transkrypcji, nieprawidłowy splicing

choroba zależy od mutacji, środowiska itd.

Diagnoza:

• test potowy- Cl^-, Na⁺ >60 mmol/l

• pomiar przeznabłonkowej różnicy potencjałów (do 30mV norma, chorzy- >35mV)

• diagnostyka molekularna

• screening- oznaczanie immunoreaktywnej trypsyny we krwi i najczęstszych mutacji w genie CFTR

brak aktywności CFTR - obniżona odporność na zakażenia bakteryjne:

1. inaktywacja defensyn- defensyny- peptydy o charakterze antybakteryjnym, są inaktywowane przez wysoki poziom Cl-, Na⁺

2. zagęszczenie śluzu → warunki beztlenowe → biofilm; bardziej odporny na antybiotyki niż pojedyncze bakterie (biofilm otacza się osłonką i praktycznie jets niemożliwy do usunięcia

fagi moga uczestniczyć w kształtowaniu str 3D biofilmu; Pf4- infekują pojedyncze kom bakteryjne → liza → powstaje kanał

3. CFTR uczestniczy też w aktywacji odpowiedzi immunologicznej po infekcji Pseudomonas aeruginosa

CFTR wiąże LPS na powierzchni kom bakteryjnej

↓

ekstrakcja LPS do kom nabłonka poprzez endocytozę

↓

translokacja czynnika NF-κB do jądra kom

↓

synteza cytokin

Endocytoza LPS i translokacja NF-κB nie zachodzą w kom nabłonka zawierającego zmutowane białko ΔF508 CFTR

Terapia:

• wysokokaloryczna dieta

• uzupełnianie enzymów trzustkowych

• antybiotyki

• leki rozszerzające oskrzela

• fizjoterapia- techniki drenażowe, tlenoterapia

• transplantacja płuca, płuco- serca (60% przeżywalności w USA)

Protein repair therapy:

• gentamycyna- supresja mutacji nonsensownych (klasy I)- białka zmutowane ale moga przybrać odpowiednią konformację

• chemical chaperones (np. glicerol); fenylomaślan → prawidłowe fałdowanie CFTR ΔF508, transport CFTR do błony

• milrinon (inhibitor fosfodiesterazy), genisteina (inhibitor kinazy tyrozynowej), CPX (cyklofenylo-1-3-dipropylokasntyna) → aktywują przpływ Cl^- przez kanał CFTR ΔF508

Terapia genowa:

• dostarczenie zdrowej kopii genu CFTR do kom nabłonka dróg oddechowych

• wektory: adenowirusy, wirusy AAV (adeno- associated virus), liposomy

• problem- bariera fizyczna i immunologiczna, niestabilność mRNA, ograniczona ekspresja genu CFTR

AGREGACYJNE:

• może być brak aktywnych Hsp

• aby pozbawić inne białka efektu toksycznego, białka opiekuńcze: przyspieszają procesy proteolizy, niektóre Hsp70 transportowane na zewnątrz i łączące się z agregatami powodują fagocytozę

• toksyczne dla kom moga być albo agregaty bądź nieprawidłowo sfałdowane polipeptydy

Choroby wywołane mutacjami w genach białek opiekuńczych:

Syndrom McKusicka- Kaufmana

• rzadka, recesywna;

• objawy: hydrometrocolpos- wady rozwojowe macicy i pochwy, polidaktylia, wrodzona choroba serca

• gen MKKA (BBS6, 20p12 - Hsp60- chaperoniny)

• brak hydrolizy ATP

Syndrom Bardeta- Biedla (BBS)

• rzadka

• objawy: barwnikowe zwyrodnienie siatkówki, polidaktylia, opóźnienie umysł, otyłość, niedorozwój narządów płciowych, nieprawidłowe funkcjonowanie nerek

• geny BBS1-6

• brak hydrolizy ATP

Ataksja spastyczna Charlevoix- Saguenay

• recesywna

• objawy: neuropatia czuciowa i ruchowa, atrofia móżdżku, hipermielinizacja nerwu wzrokowego

• gen SACS (13q11), białko saksyna, domena DnaJ i podobna do N- końca Hsp90

• delecja genu

Rola sHsp w chorobach agregacyjnych:

HspB1/Hsp27 mięśnie serca

HspB4 - α- krystalina soczewka

HspB5 - β- krystalina soczewka

Zmiany poziomu Hsp → Alzheimer, Creutzfelda- Jacoba, stwardnienie zanikowe boczne, Parkinson, stwardnienie rozsiane

Obecność Hsp27, αβ-krystalin, Hsp22 (zapobiega agregacji huntingtyny), HspB2- w płytkach starczych

CHOROBY WYWOŁANE POTRANSLACYJNYMI MODYFIKACJAMI sHsp LUB MUTACJAMI W ICH GENACH:

Katarakta

• odcięcie fragmentu białka, deaminacja, utlenienie, glikacja, fosforylacja, izomeryzacja → agregacja

• glikacja- nieenzymatyczna glikozylacja

• mutacje w genach α- krystalin

Miopatia związana z desminą

• mutacje w genach α- krystalin

Kardiomiopatia związana z desminą

• mutacje w genach α- krystalin

Dziedziczna obwodowa neuropatia motoryczna

• mutacje w genach Hsp22 i Hsp25

Choroba Charcota- Marie- Tootha

• mutacje w genach Hsp22 i Hsp25

α- krystalina:

• ~40% białek cytoplazmatycznych soczewki oka

• homo i heterooligomery αA i αB krystaliny

• 300- 1000 kDa

• struktura oligomerów jest dynamiczna- wymiana podjednostek (in vitro), również w kompleksach mieszanych αA- krystalina - Hsp27 - αB- krystalina

• αA-krystalina αB- krystalina

soczewka soczewka

siatkówka mózg

grasica śledziona

nerki

mięśnie szkieletowe

serce

• α- krystaliny- białka opiekuńcze, in vitro hamują agregację białek wywołaną szokiem termicznym, oksydacyjnym, UV i umożliwia ich renaturację z udziałem Hsp zależnych od ATP

Zaćma:

• mętnienie soczewki oka prowadzące do osłabienia ostrości i kontrastu

• katarakta wrodzona - 1,8/ 100 tys urodzeń

• kom soczewki- włókniste regularnie ułożone heksagonalne, pozbawione jąder, nieaktywne metabolicznie, cytoszkielet- brak keratyny i wimentyny, fakinina i filensyna- filamenty charakterystyczne dla soczewki, związane z α-krystaliną, stężenie białka 2x wyższe niż w innych tkankach, rozpraszanie światła zmniejsza ścisłe upakowanie oligomerów βγ- krystalin, w centralnej części mogą być białka płodowe

• modyfikacje potranslacyjne α- krystalin mogą prowadzić do agregacji białek strukturalnych soczewki - βγ- krystalin; mętnienie → zaćma (lub)

• modyfikacje potranslacyjne mają na celu utrzymanie aktywności opiekuńczych α- krystalin

• efekty mutacji α- krystalin: a) brak aktywności opiekuńczej (loss of function) b) nieprawidłowe oddziaływania z innymi białkami (gain of function)

• zaćma też przez mutacje w innych genach (koneksyny, czynnika transkrypcyjnego PitX)

• mutacja w genie αA-krystaliny powoduje kataraktę: R116C

Terapia:

• pochodna pantotenianu - pantetyna - stymuluje aktywność α- krystalin, skutki uboczne

• aspiryna, ibuprofen, paracetamol - hamują modyfikacje potranslacyjne

• acetylo-L-karnityna - acetyluje krystaliny → zapobiega ich glikacji

• karnozyna - hamuje agregację α- krystalin

Desminopatia

• mutacje w genach desminy, selenoproteiny N i miotyliny oraz mutacja w genie CRYAB αB-krystaliny

• desmina należy do filamentów pośrednich w kom mięśniowych, tworzy pierścienie oddziałujące a innymi białkami

• DRM (desmin related myopathy)- nieprawidłowa agregacja desminy w mięśniu sercowym i mięśniach szkieletowych; w agregatach też inne białka np. inne filamenty pośrednie, ubikwityna, białko prekursorowe amyloidu, αB- krystalina. Jednak choroba dotyczy głównie mięśnia sercowego

• najczęstsza mutacja αB- krystaliny- R120G - tworzy nieregularne oligomery, powoduje uszkodzenie mit i indukcję apoptozy

• u myszy ze zmutowanymi agregatami → śmierć po 6 m-cach z powodu uszkodzenia serca → ćw fizyczen zapobiegały przedwczesnej śmierci

• αB- krystalina w kom mięśniowych jest syntetyzowana na niskim poziomie, w warunkach stresowych indukowana

• αB- krystalina chroni kom mięśniowe przed stresem: a) stabilizuje cytoszkielet i miocyty b) w warunkach stresowych jest transportowana do jądra i uczestniczy w obróbce transkryptów c) oddziałuje z białkami regulującymi proces apoptozy

AMYLOIDOZY

• zewnątrzkomórkowe agregaty białek lub peptydów, produktów proteolizy

• amyloid- str bogata w poprzeczne arkusze β, białko niewrażliwe na proteolizę (cross β sheet)

• prekursor choroba

transtyretyna rodzinna polineuropatia amyloidowa

łańcuchy immunoglobulin amyloidoza pierwotna ze szpiczakiem

prekursor β amyloidu Alzheimer

priony Creutzfeldt- Jacob

• transtyretyna- normalnie produkowana w wątrobie i mózgu, agreguje w innych miejscach; transport tyroksyny i retinolu, docelowo układ nerwowy, homotetramer, mutacje → zmiany str → agregacja

• białka o różnej sekw aa mogą tworzyć podobne struktury 3-rzędowe

polipeptyd rozwinięty natywne

α- synukleina prion

amylina (DAPP) β- 2 mikroglobulina

amyloid β (Aβ) lizozym

transtyretyna (TTR)

↓ ↓

amyloid

polimorfizm włókien amyloidowych

w zależności od warunków mogą powstawać różne agregaty

Mechanizm tworzenia amyloidu

Model 1:

białko natywne lub częściowo rozwinięte w śr z zarodkiem → zmiany konformacyjne białka → włókno wydłużone o 1 monomer → zmiany str indukowane na matrycy

Model 2:

różne konformacje białka amyloidowego → wiązanie konformacji „okrągłej” → przesunięcie równowagi → wydłużone włókna

Model 3: (bez matrycy)

w mieszaninie pojawiają sie białka o str β → ligand → amyloid

Jak powstaje matryca?:

• zarodkowanie włókien amyloidu (dla 2 i 3)

• agregaty zmieniają konformację → amyloid (dla modelu 3)

DLACZEGO AMYLOIDY SĄ TOKSYCZNE?:

• amyloid uszkadza str tkanek

• oligomery tworzące włókna amyloidu uszkadzają błonę kom (to oligomery są toksyczne sic!)

• włókna oligomeru wiążą jony metali → umożliwia to syntezę reaktywnych form tlenu

Fe³⁺ + O₂^* → Fe²⁺ + O₂

H₂O₂ + Fe²⁺ → OH^* + OH^- + Fe³⁺

• we włóknach amyloidowych powstają uwięzione białka niezbędne dla prawidłowego funkcjonowanie kom

Diagnoza:

objawy kliniczne: niewydolność serca, uszkodzenie nerek, neuropatia, hepatomegalia →

EKG, echokardiogram, scyntygrafia →

biopsja (żołądek, skóra, tk tłuszczowa) →

badanie histopatologiczne (wiązanie czerwieni komgo,przeciwciał skierowanych przeciwko biakom amyloidu) →

AL (obecność białka M w surowicy) lub ATTR

Terapia:

• ATTR- transplantacja wątroby (większość agregującej TTR jest produkowana przez wątrobę, nowa wątroba będzie produkować prawidłową transterytynę)

• Tafamidis- hamuje agregację (ii/iii faza badań)

• AL- chemoterapia (melfalan) połączona z przeszczepem kom pnia z krwi obwodowej; oligonukleotydy antysensowne, siRNA → hamowanie syntezy prekursora

• chirurgiczne usuwanie guzków amyloidowych - terapia laserowa (najczęściej)

CHOROBY POLIGLUTAMINOWE

Choroba Huntingtona:

• objawy: zaburzenia emocji i procesów poznawczych, niekontrolowane ruchy kończyn, drgawki, nieprawidłowe napięcie mięśniowe, upośledzenie mimiki, depresja

• wywołana dominującą mutacją w genie kodującym huntingtynę (Htt) - 350kDa

• w egzonie - I genu htt wystepują powtórzenia CAG (Gln/Q)

• w genach osób zdrowych ilość powtórzeń <35 (Htt^wt)

• 35- 39 powtórzeń CAG - choroba może się rozwinąć lub nie

• 40- 60 powt - objawy >40 r.ż. (Htt^ex)

• >60 powt - objawy przed 20 r.ż. (Htt^ex)

• Htt^ex - (ex- extintion- zwiększona ilość Gln) - tworzy agregaty (aggresomes) w cytoplazmie i jądrze neuronów, (uszkodzenie neuronów w korze mózgowej i ciele prążkowanym)

• inne choroby poliglutaminowe - ataksje rdzeniowo móżdżkowe - powtórzenia Q w genach ataksyny

huntingtyna:

• produkcja w prawie wszystkich tkankach, w kom: jądro, ER, AG, mt, pęcherzyki synaptyczne

• rola - w embriogenezie, zahamowanie w płacie czołowym- neurodegeneracja

• agregaty w jądrze kom powstają z fragmnetu N-końcowego zawierającego sekw poliQ; przyczyny: lost of function, gain of function

• skracanie Htt sprzyja agregacji fragmentów poliQ w jądrze kom i wywołuje cytotoksyczność

wpływ Htt^ex na transkrypcję:

• sekwencje poliQ >35 wiąże czynniki transkrypcyjne w jądrze kom w formie agregatów lub rozp. - zahamowanie transkrypcji

• w cytozolu wiąże receptory transkrypcji Htt a forma zmutowana nie oddziałuje z nimi - hamowanie transkrypcji

• Htt uczestniczy w przekazywaniu sygnałów, transporcie, tworzeniu pęcherzyków synaptycznych i endocytozie

struktura agregatów:

• nanorurki wypełnione H₂O

• wiązania poliQ są stabilizowane przez wiązania wodorowe między CO, NH łańcucha głównego i NH₂ łańcucha bocznego

• agregacja tylko gdy więcej niż 40 reszt Q

• str włókna drożdżowego Sup35 przypomina agregaty Htt-Ex 1

• włókna poliQ tworzą 3 nanorurki

Rola białek szoku termicznego w usuwaniu i zapobieganiu toksyczności poliQ:

• Hsp40 i 70 hamują powstawanie włókien Htt-Ex 153Q in vitro, powodują tworzenie amorficznych agregatów rozpuszczalnych w detergencie

• Hsp hamuje śmierć neuronów indukowaną przez agregaty poliQ:

poliQ → ROS → cytochrom c → Hsp27 → apoptoza

• doświadczenie z Caenorhabditis - modelowy org do badania agregacji poliQ

• identyfikacja genów odpowiedzialnych za agregację poliQ

• gdy brak Hsp70/hsp-1 i czynnika Hsf - agregacja poliQ >33; interferencja z iRNA

• iRNA hamuje transkrypcję poliQ

Terapia:

• indukcja syntezy Hsp: - Hsp zapobiegają agregacji HttEx, uczestniczą w degradacji HttEx

• gene delivery- dostarczanie genów hsp

• poziom Hsp wzrasta po zahamowaniu aktywności Hsp90 (p. Inhibitory Hsp90- geldanamycyna, 17AAG, stres)

• są indukowane przez leki standardowo stosowane w leczeniu chorób niezwiązanych z agregacją

• statyny - inhibitory kompetycyjne HMG-CoA- kluczowego enzymu uczestniczącego w syntezie cholesterolu

• inhibitory deacetylazy histonowej (HDAC) mogą być zastosowane w terapii chorób poliQEx

• CBP koagreguje z białkami poliQEx (ma aktywność acetylotransferazy histonowej)

• inhibitpry HDAC przywracaja właściwy poziom transkryptów kodujących białka konieczne dla prawidłowego funkjonowanie neuronów - czyli hamowanie deacetylazy

• agregacja może być hamowana przez specyficzne przeciwciała produkowane w kom - intracellular antibody = intrabody

• peptydy supresorowe hamują agregaty poliQ np htt 17aa - 25Q ramię spacer- 25Q- myc (spacer- białko TBP)

• agregaty → peptyd supresorowy → niedopuszczenie do tworzenia str β

• czerwień kongo hamuje powstawanie włókien htt44Q

• oligonukleotydy sDNA z sekwencją kwadruplexów 4xG hamuje agregację HttEx

Choroba Parkinsona (PD)

• kolejna choroba neurodegeneracyjna związana z agregacją białek, należy do chorób hypokinetycznych

• objawy: sztywność mięśniowa, bradykinezja, drżenie spoczynkowe, trudności w inicjacji ruchów dowolnych, zaburzenia równowagi, brak mimiki twarzy, przodopochylenia tułowia

• 1,6%- częstość PD w EU, u osób powyżej 60 r.ż.

• zwyrodnienie neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej, prekursorem dopaminy, odpowiedzialnej za koordynację czynności ruchowych, jest L-DOPA. Kliniczne objawy pojawiają się dopiero po uszkodzeniu ok 80% (50%) kom produkujących dopaminę. W preparatach tkanki nerwowej są wykrywane Lewy bodies zawierające nierozpuszczalne agregaty białek (również w demencji; 10% ludzi z tymi ciałkami- brak objawów)

• dopamina - neuroprzekaźnik katecholaminowy, syntetyzowana i uwalniana przez neurony dopaminergiczne OUN

• hydroksylaza tyrozyny → tyrozyna → L-DOPA → dopamina

• oksydaza monoaminowa (MAO) - reguluje ilości dopaminy w synapsie (u chorych jej poziom wzrasta)

• do wykrywania objawów- PET (metoda); SPECT

• ciałka Lewiego- zawierają α- synukleinę, parkinę, neurofilamenty, αB- krystalinę, LRRK2

mutacje:

większość przypadków choroby sporadyczna

rodzinna choroba- 15%-20%

nazwa	Locus	Produkt genu	Dziedziczenie	Ciałka Lewiego
PARK1 (NSCA)	4q21-23	α- synukleina	AD	+
PARK2	6q25.2-27	parkina	AR	-
PARK5	4p14	UCHL1	AR	?
PARK7	1p36	DJ1	AR	?
PARK8	12p11.2-q13.1	dardarin	AD	-

UHCL1- ubiquitin carboxy terminal hydrolase L1- uwalnia monomery ubikwityny

DJ1- produkt onkogenu oddziałujący z c-myc, antyoksydant?

Dardarin- w j. baskijskim drżenie

PARK1- AD, w genie kodującym α- synukleinę (140aa), której agregaty tworzą ciałka Lewiego

Ekspresja α- synukleiny zachodzi w różnych częściach mózgu; lokalizacja - głównie w zakończeniach synaptycznych. Mutacje w genie α- synukleiny są rzadką przyczyną choroby. α- synukleina występuje również w ciałach Lewy'ego w przypadku sporadycznej PD

zidentyfikowane mutacje: A53T, A30P, E46K, zwielokrotnienie kopii genu (2-4x)

nadprodukcja α- synukleiny u myszy wywołuje PD

Od poziomu α- synukleiny zależy wiek, w którym zaczyna się rozwijać PD oraz objawy. Im wyższy poziom α- synukleiny tym ostrzejszy przebieg choroby - oprócz typowych objawów PD - demencja, halucynacje, uszkodzenia ukł autonomicznego

delecja genu α- synukleiny = brak fenotypu

AUTOFAGIA

• degradacja 1/3 białek cytozolowych; wymaga udziału lizosomów

• zmutowana α- synukleina blokuję autofagię

• kompleksy białek opiekuńczych (Hsc70, Hsp40,90, Hip,Hop) z α- synukleiną zmut → nie mogą być degradowane w lizosomach wtedy też nie są degradowane inne białka

• białka szoku termicznego hamują agregację α- synukleiny

PARK2

• mutacje AR w genie parkiny powodując AR-JP (autosomal recesive juvenile parkinsonizm)

• główne mutacje- del egzonów, insercje, missense

• główne mutacje powodujące odmianę rodzinną

• brak ciałek Lewy'ego!!

Parkina:

• 42kDa jest enzymem E3 (RING type) - ligazą ubikwityny (znakowanie przy degradacji)

• gen parkiny 12 egzonów, 1,4Mb

• ubikwityna (8,6kDa) aktywowana przez przyłączenie do E1 (wiązaniem tioestrowym). Z udziałem E2 i E3 ubikwityna zostaje związana C-końcową resztą Gly z grupą ε NH₂ Lys białka docelowego. Kolejne cząsteczki ubikwityny mogą być przyłączane do grupy NH₂ Lys48 ubikwityny związanej już z białkiem przeznaczonej do degradacji

• enzymy uczestniczące w znakowaniu ubikwityną: E1- 1 enzym; E2 >20; E3 >100 różnych enzymów w tym parkina

• dwie grupy E3: HECT- kowalencyjnie związane z ubikwityną; RING- type- brak kowalencujnego wiązania

• potencjalne substraty parkiny:

białko funkcja

CDCrel-1 egzocytoza

receptor Pael stres w ER

O- glikozylowana α- synukleina ciała Lewy'ego

synfilina-1 ciała Lewy'ego

cyclina E apoptoza

tubulina α/β mikrotubule

---