Program ćwiczeń z mikrobiologii dla biotechnologów

(II rok)

Ćwiczenie 1

Metody sterylizacji szkła laboratoryjnego i pożywek mikrobiologicznych.

Podłoża i pożywki mikrobiologiczne.

Praca w warunkach jałowych.

Ćwiczenie 2

Formy morfologiczne bakterii.

Podział bakterii na gram ujemne i gram dodatnie. Barwienie komórek bakteryjnych.

Budowa komórki bakteryjnej.

Ćwiczenie 3

Wpływ czynników fizykochemicznych na bakterie.

Ćwiczenie 4

Metody hodowli bakterii - w podłożu płynnym, hodowla beztlenowców

Posiew na szereg biochemiczny- badanie właściwości biochemicznych wybranych pałeczek jelitowych

Morfologia kolonii bakteryjnych na różnych podłożach mikrobiologicznych.

Ćwiczenie 5

Oznaczanie wrażliwości bakterii na chemioterapeutyki (antybiotyki, sulfonamidy, fitoncydy, bakteriocyny)

Bakteriofagi- oznaczanie wrażliwości bakterii na bakteriofagi, miano lizatu fagowego, streak-test.

Ćwiczenie 6

Podstawowe odczyny serologiczne.

Baketrie z rodzajów Neisseriae i Corynebacterium

Ziarniaki ,,γ-hemolizujące.

Ćwiczenie 7

Zaliczenie - kolokwium (wspólne dla wszystkich grup)

Ćwiczenie 1

Przygotowanie do pracy w laboratorium mikrobiologicznym

Zapoznanie studentów z instrukcją BHP

I. Metody hodowli mikroorganizmów - rodzaje podłoży mikrobiologicznych (DEMONSTRACJA):

1. podłoża płynne i stałe

2. podłoże zwyczajne (LA - Luria agar), wybiórczo-różnicujące (MacConkey'a, Chpmana), wybiórcze (selektywne; Sabouroda).

II. Sterylizacja w autoklawie i aparacie Kocha

Mamy do dyspozycji sześć probówek z jałowym bulionem.

probówki: 1, 2, 3 należy zaszczepić hodowlą nocną Escherichia coli (po 100l),

probówki: 4, 5, 6 zaszczepić hodowlą nocną Bacillus subtilis (po 100l).

1. probówki 1 i 4 jałowić w autoklawie przez 30 min. w temp. 121^oC

2. probówki 2 i 5 jałowić w aparacie Kocha przez 30 minut.

3. probówki 3 i 6 - nie jałowić (kontrola).

Probówki inkubować w wytrząsarce w 37^oC przez 24 godziny, a następnie schować do lodówki. Wyniki doświadczenia będą omówione na następnych ćwiczeniach. Hodowle wyjściowe badanych bakterii również zostaną przechowane do następnych ćwiczeń w celu wybarwienia przetrwalników i wykonania preparatów mikroskopowych.

III. Sterylizacja przez sączenie (DEMONSTRACJA)

IV. Posiew bakterii na podłoże stałe:

1. posiew redukcyjny Escherichia coli - każdy student wykonuje posiew na podłożu LA

2. posiew w postaci murawy - każda para wysiewa na podłoże LA

- 0,1 ml hodowli E. coli

- 0,1 ml hodowli Bacillus subtilis (do wyboru bakterie po autoklawowaniu, po gotowaniu w aparacie Kocha, hodowle kontrolne)

3. łapanie bakterii z powietrza każda para ma do dyspozycji 1 płytkę

4. posiew na skos E. coli.

5. posiew na słupek E. coli.

Każda para ma do dyspozycji 6 płytek LA

V. Obserwacja wzrostu mikroorganizmów, morfologia kolonii na podłożach stałych i płynnych

1. podłoże Chapmana - (Staphylococcus, Micrococcus sp.)

2. podłoże McConkeya (E. coli - lac⁺, Serratia marcescens).

3. podłoże Sabourouda (Candida sp., E. coli).

4. Agar wzbogacony

Pałeczki

E.coli, Erwinia lejąca się, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Salmonella anatum, Klebsiella oxytoca, Flavobacterium okeanokoites, Enterobacter spp. Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas spp. Brunatny, Pseudomonas spp.( Fluoryzujący), Xanthomonas,

Laseczki

Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus spp.

Ziarniaki

Micrococcus sp, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Gafkya tetragena, Sarcina spp.

Drożdzaki

Candida sp. Candida albicans.

Bakterie dnia:

Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus spp.

WIADOMOŚCI TEORETYCZNE.

1. Mycie i sterylizacja szkła laboratoryjnego.

a) szkło nowe - posiada odczyn zasadowy - eliminacja przez zanurzenie w 1% HCl lub 15 minutowe gotowanie.

b) szkło używane - 24h moczenie w chromiance (dwuchromian potasu, kwas siarkowy i woda).

Sterylizacja - (łac. sterylis - jałowy) - proces zabicia drobnoustrojów (formy wegetatywne i przetrwalnikowe).

Metody sterylizacji:

a) fizyczne - sterylizacja cieplna (sucha) lub z parą wodną,

sterylizacja UV,

sterylizacja promieniami jonizującymi,

sterylizacja ultradźwiękami.

b) mechaniczne (filtracja),

c) chemiczne (dezynfekcja).

Ad a) Sterylizacja cieplna-sucha:

* wyżarzanie (ezy, igły, skalpele)

* opalanie (brzeg probówki, bagietki)

* suszenie (szkło laboratoryjne)

140oC - 2,5h, 170oC - 1,0h

Sterylizacja parą wodną

* gotowanie (strzykawki, instrumenty chirurgiczne)

* autoklawowanie (pożywki)

0,7 atm. - 117oC; 3,0 atm - 134oC

* jałowienie w aparacie Kocha (pożywki do 100oC).

Pasteryzacja - stosowana w celu zniszczenia form wegetatywnych w płynnych środkach spożywczych (np. w mleku) - jednorazowe podgrzanie do 60-80oC.

Tyndalizacja - pasteryzacja frakcjonowana. Niszczy formy wegetatywne i przetrwalnikowe -

3-krotna pasteryzacja w odstępach 24h.

Sterylizacja UV (długość fali 250nm) - uszkadza strukturę kwasów nukleinowych (DNA) - stosowana do sterylizacji pomieszczeń, naczyń z tworzyw sztucznych i plastikowych. Najmniej odporne są zarodniki pleśni.

Ultradźwięki - fale dźwiękowe powyżej 20 tys. Hz - metoda oparta na zjawisku kawitacji. Polega na rozrywaniu roztworu przez powstanie w nim pęcherzyków gazów, co prowadzi do mechanicznego rozerwania komórek od wewnątrz. Metodą tą nie można zabić przetrwalników.

Ad b) Filtracja (podłoża płynne np. surowica, roztwór mocznika, witaminy) - przy filtracji często stosuje się podciśnienie.

* filtry z ziemi okrzemkowej (Berkefelda),

* filtry z porcelany (Chamberlanda),

* filtry teflonowe

* filtry ze spiekanego szkła (schotta),

* filtry membranowe (molekularne) - z pergaminu, żelatyny, błon zwierzęcych (zatrzymują wirusy).

Ad c) Dezynfekcja (chemiczna metoda sterylizacji) - jest to proces oczyszczania powierzchni stołów, narzędzi od drobnoustrojów zdolnych wywołać zakażenie (nie niszczy form przetrwalnych).

Na siłę działania środków bakteriobójczych (dezynfekujących) mają wpływ następujące czynniki:

* rodzaj i wrażliwość drobnoustrojów,

* czas działania środka chemicznego,

* temperatura środowiska,

* stężenie środka dezynfekującego.

Środki dezynfekujące pomieszczenia i przedmioty:

* kwasy i zasady - 10% roztwory zasad, mleko wapienne - niszczą przedmioty

* środki utleniające - po zetknięciu z komórkami drobnoustrojów wydzielają zjonizowany tlen, w wyniku czego następuje uszkodzenie struktury błon cytoplazmatycznych (niszczą też przetrwalniki - działają tak jak ozon). Podchloryny, chloraminy, jodyna (10% roztwór jodu), 3% woda utleniona.

* sole metali ciężkich (głównie srebra i rtęci) - precypitacja i inaktywacja białek.

* organiczne związki dezynfekujące:

- alkohole - denaturacja białek.

- fenole i krezole - trucizny protoplazmatyczne - wchodzą w reakcje ze ścianą komórkową (niszczą formy wegetatywne bakterii i grzybów, na przetrwalniki oddziaływają słabo). Przykłady: fenol, lizol, formaldehyd.

* detergenty - czwartorzędowe związki amoniowe (posiadają dużą aktywność powierzchniową) - łączy się je z chlorowcami. Uszkadzają błony komórkowe, ale nie niszczą spor. Przykłady: Zephirol, Desogen, Sterinol.

Środki dezynfekujące powietrze - gazy, para, aerozole - glikol propylenowy, trietylenoglikol, podchloryn sodu, sterinol, kwas mlekowy.

Siłę działania związku dezynfekcyjnego określa się przez porównanie jego działania do działania fenolu - tzw. współczynnik fenolowy (stosunek największego rozcieńczenia badanego związku zabijającego mikroorganizmy w ciągu 10 min. do największego rozcieńczenia fenolu zabijającego mikroorganizmy w 10 min.

2. Pożywki i podłoża mikrobiologiczne.

Pożywki (podłoża) - płynne lub zestalone mieszaniny złożone z odpowiednio dobranych składników, służących hodowli drobnoustrojów in vitro (w szkle).

Pożywki muszą:

a) zawierać związki odżywcze (pierwiastki biogenne C,N,O,H,S,P). Jako Źródła węgla, azotu, aminokwasów i witamin stosuje się pepton. Jest to produkt enzymatycznej hydrolizy białek za pomocą pepsyny i HCl. Jest to mieszanina proteaz, polipeptydów i aminokwasów.

b) mieć odpowiednie pH (z reguły 7,2-7,4).

c) być jałowe,

d) obyć izotoniczne (podobne ciśnienie jak w komórkach drobnoustrojów, zwykle uzyskuje się przez dodanie soli NaCl). Podłoże hipotoniczne (o niższym ciśnieniu osmotycznym, niż w komórkach) powoduje pęcznienie komórek, a nawet ich pękanie. W podłożu hipertonicznym (o wyższym ciśnieniu osmotycznym, niż w komórkach) następuje kurczenie się plazmy komórkowej i oddzielanie od ściany komórkowej (plazmoliza).

e) być jednorodne.

Podział pożywek ze względu na charakter składników:

* naturalne (wyciąg z krwi, z tkanek roślinnych i zwierzęcych, mleko),

* syntetyczne (mieszanina substancji organicznych i nieorganicznych),

* półsyntetyczne (mieszane).

Podział pożywek ze względu na wymagania odżywcze drobnoustrojów:

* proste - bulion odżywczy, agar odżywczy.

* złożone - jak wyżej plus witaminy, substancje wzrostowe itp. Wśród nich wyróżnia się:

- podłoża selektywne (wybiórcze) - które zawierają 1 lub 2 składniki hamujące rozwój drobnoustrojów, które chcemy wyeliminować z hodowli.

- podłoża różnicujące (identyfikacyjne) - zawierają charakterystyczną substancje, która jest enzymatycznie rozkładana wyłącznie przez określone gatunki drobnoustrojów.

Autotrofy - nie wymagają do wzrostu związków organicznych.

Prototrofy - wymagają do wzrostu 1 związku organicznego (rosną na ubogich pożywkach).

Heterotrofy - wymagają do wzrostu obecności w pożywce związków organicznych: (cukry - Źródło węgla), (aminokwasy - żądło azotu), witamin i innych.

Auksotrofy - to heterotrofy, które potrzebują poza jednym stosunkowo prostym związkiem organicznym, jeszcze co najmniej jednego związku organicznego, jak np. aminokwasy lub witaminy.

Hypotrofy - bezwzględne pasożyty - bytują w organizmie gospodarza.

Podział pożywek ze względu na konsystencję:

- płynne (bulion, podłoże mineralne, brzeczka).

- stałe (zestalone) - agar, podłoże żelatynowe.

- półpłynne - zawierają 0,15-0,2% agaru.

Agar - wielocukier zawierający galaktozę, resztę siarczanową, jony Ca+2 i Mg+2 (uzyskuje się go z krasnorostów). Rozpuszczalny w wodzie w temperaturze 95 - 99oC, krzepnie zaś w temperaturze 45 - 49oC. Tylko nieliczne bakterie morskie i glebowe go rozkładają. W środowisku kwaśnym ulega hydrolizie i traci zdolność do tworzenia żelu.

żelatyna - białko proste otrzymywane z chrząstek. Rozpuszcza się w ciepłej wodzie, a w temperaturze 25oC tworzy galaretowaty żel. Jest upłynniana i rozkładana przez bakterie i grzyby wytwarzające enzymy proteolityczne (hydrolizujące białko). Nie nadaje się do hodowli drobnoustrojów, ale ma zastosowanie do badania proteolitycznych właściwości drobnoustrojów.

Podłoże McConkey - zawiera sole żółci, które hamują rozwój większości bakterii. Na bazie tego podłoża przygotowuje się pożywkę wybiórczą i różnicującą.

*wybiórcza - dezoksycholan sodu pozwala na rozwój pałeczek z rodzaju Enterobacteriae (żyjące w przewodzie pokarmowym człowieka) i Enterocoki.

*różnicująca - zawiera laktozę i wskaźnik barwny - czerwień obojętną. Bakterie lac+ (rozkładają laktozę - zmiana zabarwienia pożywki na kolor fioletowy), bakterie lac- (bez zmian).

Podłoże Chapmana - dla gronkowców.

*wybiórcza - wysokie stężenie NaCl (7,5%) - hamuje rozwój większości drobnoustrojów (rosną gronkowce).

*różnicująca - mannitol 1% - substancja diagnostyczna i różnicująca. Część gronkowców rozkłada mannitol i następuje zmiana pH pożywki, a w efekcie obserwujemy zmianę zabarwienia (wskaźnik barwny - czerwień fenolowa).

Podłoże Sabourouda - podłoże do hodowli drożdży i grzybów.

*wybiórcza - niskie pH (4,4 - 4,5) i obecność glukozy.

OBSERWACJE I WNIOSKI.

Zagadnienia teoretyczne.

Czym są drobnoustroje? Organizmy prokariotyczne i eukariotyczne. Do czego służą podłoża mikrobiologiczne. Czym jest czysta kultura danego drobnoustroju, czym jest kultura mieszana. Rodzaje pożywek mikrobiologicznych: płynne i stałe; naturalne, syntetyczne i półsyntetyczne; minimalne, pełne, wzbogacone i specjalne (różnicujące, wybiórcze = selektywne, wybiórczo-różnicujące); Czym jest i do czego służy agar. Jakie warunki powinna spełniać pożywka mikrobiologiczna, aby zapewnić warunki, optymalne dla wzrostu badanych mikroorganizmów? Autotrofy i heterotrofy; prototrofy i auksotrofy.

Co oznacza: sterylizacja = jałowienie, pateryzacja, tyndalizacja, dezynfekcja, sanityzacja, aseptyka, antyseptyka - w jakim celu je się wykonuje? Jakie są sposoby sterylizacji (fizyczne, chemiczne, mechaniczne?. Do czego służą: autoklaw i aparat Kocha. W jaki sposób jałowi się: wodę i roztwory soli i pożywki (lub składniki pożywek) termostabilne (odporne na wysoka temperaturę); w jaki sposób sterylizuje pożywki lub składniki pożywek wrażliwe na wysoką temperaturę (termolabilne). W jaki sposób sterylizuje się szkoło laboratoryjne, narzędzia metalowe, pomieszczenia laboratoryjne. Przykłady zastosowania dezynfekcji. Rodzaje posiewów bakteriologicznych. W jakim celu wykonuje się posiew redukcyjny. Co oznacza termin „inokulacja”. Co wiesz o bakteriach Escherichia coli i Bacillus sp.

Ćwiczenie 2

Formy morfologiczne bakterii.

Podział bakterii na gram ujemne i gram dodatnie. Barwienie komórek bakteryjnych.

Budowa komórki bakteryjnej.

Materiał do ćwiczeń

Pałeczki

E.coli, Erwinia chrysanthemii - lejąca się, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Salmonella anatum, Klebsiella oxytoca, Flavobacterium okeanokoites, Enterobacter spp. Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas spp. Brunatny, Pseudomonas spp.( Fluoryzujący), Xanthomonas,Citrobacter freundii

Laseczki

Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus spp.

Ziarniaki

Micrococcus sp, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Gafkya tetragena, Sarcina spp.

Krętki

Vibrio harveyi, Vibrio fischeri,

Drożdzaki

Candida glabrata. Candida albicans., Sacharomuces cerevisiae

I. Wygląd kolonii różnych gatunków bakterii, wyrosłych na podłożach agarowych

Każdy student samodzielnie dokonuje opisu wyglądu kolonii bakteryjnych, z uwzględnieniem ich: zabarwienia; kształtu (okrągły, nieregularny, owalny); brzegu kolonii (gładki, falisty, poszarpany); przekroju (płask, stożkowa, wypukła); powierzchni (lśniąca, matowa, pomarszczona, grudkowata); konsystencji (miękka, sucha, śluzowata,); zapachu

II. Barwienie złożone bakterii metodą Grama

1. Bakterie nanieść na szkiełko podstawowe.

• W przypadku wykonywania preparatu z hodowli płynnej, wystarczy nanieść na szkiełko kroplę hodowli, pobraną ezą i rozprowadzić zawiesiną na powierzchni szkiełka.

• W przypadku wykonywania preparatu z bakterii, wyrosłych na podłożu stałym, należy pobrać materiał jałową ezą, a następnie zawiesić bakterie w kropli soli fizjologicznej (0,85% NaCl), naniesionej na szkiełko podstawowe.

2. Po wyschnięciu, preparat utrwalić poprzez przeciągnięcie szkiełka podstawowego nad płomieniem palnika. Nie trzymać szkiełka w płomieniu!

3. Na utrwalone bakterie nanieść fiolet krystaliczny, tak aby całkowicie pokrył powierzchnię z bakteriami. Barwnik pozostawić przez 2 minuty.

4. Zmyć fiolet krystaliczny wodą destylowaną.

5. Nanieść płyn Lugola i pozostawić przez 1 minutę. Spłukać wodą destylowaną.

6. Spłukać obficie alkoholem etylowym (odbarwianie), a następnie wodą destylowaną.

7. Nanieść roztwór fuksyny zasadowej i pozostawić na 40 sekund. Spłukać wodą i pozostawić preparat do wyschnięcia.

     Po barwieniu fioletem i dobarwianiu płynem Lugola wszystkie komórki bakteryjne są zabarwione na fioletowo. Pod wpływem alkoholu z acetonem odbarwiają się wyłącznie bakterie Gram-ujemne. Ściana komórkowa bakterii Gram-dodatnich zatrzymuje kompleks filetu z jodem i komórki pozostają zabarwione na fioletowo. Odbarwione komórki bakterii Gram-ujemnych wybarwiają się fuksyną na kontrastowy, różowoczerwony kolor.

3. Barwienie proste bakterii błękitem metylenowym.

1. Bakterie nanieść na szkiełko podstawowe.

2. Po wyschnięciu, preparat utrwalić poprzez przeciągnięcie szkiełka podstawowego nad płomieniem palnika. Nie trzymać szkiełka w płomieniu!

3. Nanieść roztwór błękitu metylenowego i pozostawić na 5 minut.

4. Delikatnie spłukać wodą destylowaną i pozostawić preparat do wyschnięcia.

4. Barwienie pozytywno-negatywne w celu uwidocznienia otoczek bakteryjnych (met. Manevala)

1. Na szkiełku przedmiotowym zmieszać 1 kroplę odczynnika Maneval A (1% r0ztwór wodny czerwieni Kongo z 1 kroplą hodowli badanych bakterii.

2. Po rozprowadzeniu próby na szkiełku przedmiotowym pozostawić preparat do wyschnięcia.

3. Następnie nakroplić na szkiełko odczynnik Maneval B (5% roztwór fenolu, 20% kwas octowy, 30% chlorek żelazowy, 1% kwaśna fuksyna) i pozostawić na 5 minut.

4. Preparat spłukać wodą i wysuszyć.

W wyniku barwienia komórki bakteryjne wybarwiają się na czerwono, tło preparatu jest niebieskie, zaś otoczki bakteryjne pozostają bezbarwne.

Barwimy Klebsiella oxytoca i cyanobakterie

5. Barwienie przetrwalników metodą Dornera

1. W probówce zmieszać 0.3 ml zawiesiny bakteryjnej w soli fizjologicznej oraz 0.3 ml stężonej fuksyny karbolowej.

2. Probówkę umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 70^oC i inkubować przez 20 minut.

3. Pobrać ezą zawiesinę bakteryjną i umieścić ją na szkiełku przedmiotowym.

4. Dodać kroplę roztworu nigrozyny, zmieszać ją z zawiesiną bakteryjną a następnie rozprowadzić na szkiełku przedmiotowym.

5. Preparat wysuszyć na wolnym powietrzu,

6. Dodać kroplę olejku immersyjnego i oglądać w mikroskopie.

W wyniku barwienia obserwuje się na ciemno-szarym od nigrozyny tle czerwone przetrwalniki i najczęściej bezbarwne komórki bakterii.

6. Obserwacja mikroskopowa preparatów barwionych.

1. Barwione preparaty bakterii oglądamy pod dużym powiększeniem, stosując obiektywy imersyjne.

2. Przed umieszczeniem preparatu na stoliku mikroskopu, na szkiełko nanosimy kroplę olejku imersyjnego.

3. Preparat umieszczamy na stoliku i zanurzamy obiektyw mikroskopu w olejku. Olejek, wypełniający przestrzeń pomiędzy preparatem a obiektywem mikroskopu, zapewnia lepsze warunki oświetlenie preparatu, gdyż jego współczynnik załamania światła jest zbliżony do współczynnika szkła.

4. Ustawiamy ostrość, najpierw przy użyciu śruby makrometrycznej, a nastepnie mikrometrycznej.

5. Po zakończeniu pracy, obiektyw mikroskopu należy przetrzeć bibułką, nasączoną ksylenem, w celu oczyszczenia z olejku imersyjnego.

6. Należy przestrzegać zasady, iż oświetlenie włączamy WYŁĄCZNIE podczas obserwacji preparatu.

Bakterie dnia:

Sacharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis, Candida thermophilus

WIADOMOŚCI TEORETYCZNE.

1. Rodzaje mikroskopów:

- prosty,

- ultrafioletowy - ma lepszą zdolność rozdzielczą,

- ciemnego pola - wyraźniejszy obraz dzięki zwiększonemu kontrastowi,

- fluorescencyjny,

- kontrastowo-fazowy,

- elektronowy.

Powiększenie mikroskopu - iloczyn powiększenia okularu i obiektywu.

Zdolność rozdzielcza - najmniejsza odległość między dwoma punktami, przy której widoczne są oddzielnie.

Imersja - wypełnienie przestrzeni między preparatem a obiektywem płynem o wyższym współczynniku załamania niż powietrze (olejek imersyjny). Usuwa zjawisko załamania się promieni świetlnych przy przechodzeniu ze środowiska optycznie gęstszego (szkło) do środowiska optycznie rzadszego (powietrze).

2. Formy morfologiczne bakterii:

- kuliste: ziarniak (Micrococcus), dwoinka (Diplococcus), czworaczki (Tetracoccus), sześcianka-pakietowiec (Sarcinia), paciorkowce, gronkowce (Staphylococcus).

- cylindryczne: pałeczki (Bacterium), laseczki (Bacillus).

- spiralne: krętki, śrubowce (Spirillum), przecinkowce (Vibrio).

Opisując morfologię (wygląd) kolonii bakteryjnych zwracamy uwagę na następujące cechy:

• kształt - okrągły, nieregularny, promienisty, korzonkowaty, koncentryczny

• wielkość - średnica kolonii oceniana w milimetrach

• wzniesienie nad powierzchnię podłoża - kolonie mogą być płaskie, wzniesione, soczewkowate, pępkowate, stożkowate

• struktura - bezpostaciowa, drobno- lub gruboziarnista, włóknista

• powierzchnia - gładka, matowa, błyszcząca, szorstka, brodawkowata, pomarszczona, sucha, wilgotna

• brzegi - równe, faliste, ząbkowane, postrzępione, poszarpane

• barwa - zależy od barwników wytwarzanych przez bakterie

• przezroczystość - przezroczyste, półprzezroczyste, nieprzezroczyste

• zróżnicowanie - możliwość wyodrębnienia w kolonii części centralnej i brzegowej

• zmiany podłoża wokół kolonii - zabarwienie podłoża, zmętnienie, hemoliza podłoża krwawego

• zapach - może być nieswoisty, podobny dla wielu gatunków bakterii, może też być swoisty, charakterystyczny dla danego gatunku, związany z produktami metabolizmu bakterii (zapach miodu, jaśminu, zjełczałego tłuszczu, gnilny)

3. Metody barwienia:

Celem barwienia jest ułatwienie obserwacji.

Odczyn zasadowy barwników wykazuje powinowactwo do kwaśnego odczynu składników chemicznych ściany komórkowej.

Podział:

- barwienie proste: błękit metylowy (5), fuksyna (30).

- barwienie złożone:

- pozytywne - zabarwienie wnętrza komórki.

- negatywne - zabarwienie tła (nigrozyna, tusz chiński, czerwień Kongo).

- negatywno-pozytywne

Barwienie przyżyciowe - odróżnienie komórek żywych od martwych, które się zabarwiają (błękit metylowy, saponina). Barwnik jest pochłaniany tylko przez komórki żywe.

Różnice i podobieństwa w budowie komórek prokariotycznych i eukariotycznych.

PROKARYOTA		EUKARYOTA
1. błona cytoplazmatyczna		1. błona cytoplazmatyczna
2. ściana komórkowa		2. ściana komórkowa (wyłącznie w w komórkach roślinnych)
3. nukleoid (funkcjonalny odpowiednik jądra) - nagi zawieszony w cytoplażmie splątek DNA - podwójna helikoida.		3. jądro komórkowe z jąderkiem i chromosomami osłonięte błoną jądrową.
4. mezosomy oraz wpuklenia błony cytoplazmatycznej		4. mitochondria - centra procesów energetycznych
5. ziarna chromatoforowe		5. plastydy
6. rybosomy		6. rybosomy
7. brak		7. lizosomy
8. brak		8. reticulum endoplazmatyczne
9. brak		9. aparat Golgiego
U PROCARIOTA brak również:
- centromeru,
- wrzeciona mitotycznego,
- fazy diploidalnej,
- podziału redukcyjnego.

4. Ściana komórkowa:

Bakterie G (+) - kw. tejchojowe:

* fosforan glicerolu,

* fosforan rybitolu,

- wielocukry,

- białka,

- za swoistość antygenową odpowiada białko,

- grubość ściany komórkowej wynosi 15-50 nm.

Bakterie G (-) - lipolisacharyd - LPS,

- lipoproteina - LP,

- białka,

- lipidy,

- za swoistość antygenową odpowiada wielocukier wchodzący w skład LPS,

- białka działają jako enzymy autolityczne,

- grubość ściany komórkowej wynosi 2-10 nm.

5. Skład chemiczny komórek bakteryjnych:

73 - 85% stanowi woda

W suchej masie:

- 40-60% s.m. stanowią białka. Występuje charakterystyczny dla bakterii kwas ,-dwuaminopimelinowy oraz jego D-izomery. Brak lub prawie brak białek zasadowych (arginina, lizyna), protamin i histonów.

- 17% kw. nukleinowe (stosunek A+T / G+C nie jest równy 1).

- 10% cukry - materiałem zapasowym jest granuloza (podobna do skrobi), glikogen bakteryjny, mukopeptyd, kwasy tejchoinowe. Nie występuje celulozy (wyjątkowo u Acetobacter występuje).

- 10% lipidy - materiałem zapasowym jest polimer kwasu -hydroksymasłowego, LPS (lipolisacharyd), LP (lipoproteina), rzadko mat. zapasowym są glicerydy, brak jest kwasów nienasyconych, steroli, cholesterolu.

- Witaminy i czynniki wzrostowe - nie wymagają do wzrostu witaminy C, A, D.

6. Przetrwalniki - formy spoczynkowe bardzo oporne na wysuszenie dzieki obecności dużej ilości kwasu dwupikolinowego), temperaturę oraz działanie czynników chemicznych.

Powstają w procesie sporulacji, w którym następuje aktywacja szeregu genów. Sporulacja rozpoczyna się od izolacji końcowej części DNA bakteryjnego przez błonę rosnącą do wewnątrz. Dwie błony przetrwalnika rozpoczynają czynną syntezę specjalnych warstw, które będą stanowiły osłony komórkowe. Całkowicie ukształtowany przetrwalnik posiada:

- rdzeń - protoplast przetrwalnika posiadający chromosom i wszystkie elementy do syntezy białek,

- ścianę przetrwalnika,

- korę - najgrubszą warstwę przetrwalnika,

- płaszcz - zbudowany z białka keratynopodobnego,

- egzosporium - błonę lipidową.

Zagadnienia teoretyczne.

Budowa komórki bakteryjnej: formy morfologiczne bakterii, wielkość komórek bakteryjnych, budowa komórki bakteryjnej. Różnica pomiędzy organizmami prokariotycznymi a eukariotycznymi. Budowa ściany komórkowej bakterii gramdodatnich i gramujemnych Co to jest endotoksyna? Co to jest antygen somatyczny? Budowa błony zewnętrznej bakterii gramujemnych. Co to jest przestrzeń periplazmatyczna, mureina, pseudomureina, otoczka, glikokaliks, warstwa S, protoplast, sferoplast. Enzymy występujące w przestrzeni periplazmatycznej oraz błonie zewnętrznej, dlaczego bakterie gramujemne są oporne na penicylinę

Barwienie bakterii i przygotowanie preparatów mikroskopowych - dlaczego barwi się bakterie w celu przygotowania preparatów, barwienie proste, złożone, pozytywne, negatywne? Jakie sposoby barwienia stosuje się w celu uwidocznienia komórek bakteryjnych, przetrwalników oraz otoczek. Jaka grupa substancji pozwala na wybarwienie komórek bakteryjnych? Na czym polega barwienie metodą Grama?

Obserwacja mikroskopowa preparatów - rodzaje mikroskopów, budowa mikroskopu świetlnego, obiektyw immersyjny

ĆWICZENIE 3

WPŁYW CZYNNIKÓW FIZYKO-CHEMICZNYCH NA BAKTERIE

Materiał do badań: hodowle płynne bakterii Escherichia coli i Bacillus subtili, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Sacharomyces lub Candida

Podłoża: podłoże stałe LA (płytki: 4 duże - (śmierć cieplna) + 20 małych (UV; dezynfekcja - po 2 na parę)

Odczynniki: 3% woda utleniona, jodyna, 70% alkohol, 2% sterinol, 1,5% chloramina, 40% formalina

Każda para wykonuje wszystkie doświadczenia dla jednego z gatunków tak by cała grupa przetestowała wszystkie gatunki bakterii.

I. Wpływ temperatury na przeżywalność drobnoustrojów - Wyznaczanie czasu śmierci cieplej w temperaturze 60C i 100C dla badanych gatunków bakterii

Czas śmierci cieplej - czas potrzebny do zabicia wszystkich drobnoustrojów danego gatunku, w określonych warunkach, w danej temperaturze. Punkt śmierci cieplnej - najniższa temperatura, w której dany organizm ginie w ciągu 10 minut.

• Do dwóch probówek wprowadzamy po 1 ml hodowli nocnej bakterii,

• Probówki umieszczamy w łaźni wodnej o temperaturze, odpowiednio 60C oraz 100C.

• W czasie: 0, 5, 10, 20, 30 i 40 minut od momentu rozpoczęcia inkubacji, hodowle wysiewamy na płytki z podłożem agarowym.

• Po 24-godzinnej inkubacji płytek w temperaturze 37C określamy czas śmierci cieplnej w temperaturze 60C oraz 100C, dla obu badanych gatunków bakterii.

II. Wpływ promieniowania UV na hodowle bakterii.

1. Na płytki agarowe (2 płytki na parę) wysiewamy murawą po 0,2 ml hodowli nocnych badanych bakterii

2. Płytki z wysianymi bakteriami eksponujemy na promieniowanie UV przez 0,5, 1, 5, 10, 20, 30 minut (każda para przez inny okres czasu). W trakcie naświetlania płytki przykrywamy wieczkiem do połowy (ponieważ promieniowanie UV nie przenika przez szkło, okryta część płytki posłuży jako kontrola)

3. Płytki inkubujemy 24 godziny w temperaturze 37C.

III. Skuteczność działania wybranych środków dezynfekcyjnych na bakterie

70% etanol, 2% sterinol, 1,5% chloramina, 3% H₂O₂, Sefril.

1. Każda para bada wpływ wszystkich środków dezynfekcyjnych na badany gatunek bakterii.

2. Płytki dzielimy 6 sektorów, opisanych: 0, 5, 10, 30, 45 i 60 minut.

3. Do 2 jałowych probówek (na parę) wprowadzamy 2 ml wybranego środka dezynfekcyjnego, po czym zawieszamy w nich bakterie każdego z badanych gatunków, pobrane z podłoża stałego. Zawartość probówek dokładnie mieszamy.

4. W czasach 0, 5, 10, 30 i 60 minut od momentu rozpoczęcia inkubacji, zawiesiny bakterii wysiewamy ezą na płytkę agarową.

5. Płytki inkubujemy 24 godziny w temperaturze 37C.

IV. Badanie wpływu pH na wzrost bakterii.

Na płytki z agarem wzbogaconym o pH 5, 6, 7, 8, 9, i 10 wysiewamy badany gatunek bakterii i pozostawiamy do inkubacji 24godziny.

WIADOMOŚCI TEORETYCZNE.

1. Wpływ temperatury na drobnoustroje.

Temperatura jest najważniejszym czynnikiem zewnętrznym wpływającym na wzrost bakterii (aktywność enzymów i szybkość reakcji metabolicznych zależy od temperatury).

Podział drobnoustrojów ze względu na tolerancję temperatury:

a) Psychrofile - zimnolubne (temperatura optymalna 15-20^oC)

b) Mezofile (temperatura optymalna 20-40^oC)

c) Termofile - ciepłolubne (temperatura optymalna 45-60^oC)

Psychrofile - saprofity i drobnoustroje chorobotwórcze dla ryb. Występują w glebie, w zimnych jeziorach i morzach. Znoszą niską temperaturę dzięki ewolucyjnemu przystosowaniu do specyficznych warunków. Drobnoustroje te posiadają enzymy, które aktywują się w niskiej temperaturze. Zmiana przepuszczalności błon cytoplazmatycznych wiąże się z wyższym poziomem nienasyconych kwasów tłuszczowych w błonach komórkowych. Dzięki temu błony komórkowe psychrofili nie tracą elastyczności w niskich temperaturach.

Mezofile - są najbardziej rozpowszechnione. W tej grupie występuje większość saprofitów bytujących w glebie i w wodzie. W tej grupie znajdują się również wszystkie bakterie chorobotwórcze. Gdy temperatura spada poniżej minimum, to zachodzi represja gromadzenia w komórkach aminokwasów i włączania ich do białek. Gdy temperatura wyższa od optymalnej, to następuje degradacja RNA.

Termofile - występują w nawozie, fermentujących resztkach roślinnych, w jelitach niektórych zwierząt, w gorących Ÿródłach. Należą do tej grupy głównie bakterie z rodzaju Bacillus (przetrwalnikujące, G(+)). Termofile posiadają białko o dużej termostabilności i mają zdolność do szybkiej regeneracji białka, które utraciło aktywność.

2. Bakteriobójcze działanie wysokiej temperatury:

a) Pod wpływem wysokiej temperatury następuje denaturacja białek (skuteczniejsze jest gorące i wilgotne powietrze, nią gorące i suche).

b) Obecność w podłożu cukrów, białek i soli stwarza barierę ochronną dla drobnoustrojów.

c) Ochronne działanie ma również obojętne pH podłoża (za wyjątkiem bakterii kwasoopornych, które posiadają osłonę woskową).

d) Starsze komórki są bardziej oporne na działanie wysokiej temperatury.

e) Bakterie nie tworzące endospor i formy wegetatywne bakterii przetrwalnikujących giną w temperaturze 60-70^oC, endospory w 100^oC.

f) Przetrwalniki zawierają enzymy ciepłooporne. Pod wpływem wysokiej temperatury racemaza L-alaniny, przekształca ją w D-alaninę, która hamuje kiełkowanie endospor. Enzymy ciepłooporne związane są z kompleksem cząsteczkowym, który zawiera kwas dwupikolinowy.

3. Wpływ promieniowania UV na drobnoustroje.

Fale o długości 230-270nm wywierają silne działanie biologiczne. Są one absorbowane przez kwasy nukleinowe i białka (kwasy 25-50 razy więcej).

a) Po naświetleniu cytozyna ulega hydratacji i powstają dimery tyminy, cytozyny i mieszane dimery cytozyno-tyminowe. Zmiany te mogą uniemożliwiĆ replikację DNA i mogą spowodowaĆ śmierĆ lub błędne podstawianie zasad w czasie replikacji (mutanty).

b) W bakteriach fotoreaktywowanych powstają specjalne enzymy zdolne do wycinania z łañcucha polinukleotydowego dimerów timiny, a brakujące zasady są ponownie wbudowywane.

c) Fotodynamiczne uczulenie występuje w przypadku, gdy doda się do hodowli bakterii barwniki (błękit toluidynowy, eozynę, safraninę). Po wystawieniu bakterii na działanie światła (lub części widma słonecznego) - bakterie giną.

d) UV ma małą przenikliwość. Działa powierzchniowo. Pod wpływem UV występują zmiany w podłożu (tworzy się nadtlenek wodoru i wolne rodniki OH), które to związki mają właściwości utleniające, a więc toksyczne dla bakterii - działanie pośrednie.

4. Wpływ środków dezynfekcyjnych na drobnoustroje.

- Alkohole - denaturacja białek i rozpuszczanie lipidów.

- Chloraminy - chloramid sodowy kwasu p-toulenosulfonowego (30% czynnego chloru), działa odkażająco, odwadniająco i utleniająco. Chlorowce, jod, inaktywują białka (reagują z tyrozyną). Chlor reaguje z wodą tworząc kwas podchlorowy, który ma właściwości utleniające.

- Formalina - roztwór aldehydu mrówkowego, silny środek bakterio- i wirusobójczy (służy do odkażania narzędzi laboratoryjnych i hirurgicznych).

- Sterinol - detergent hamujący rozwój bakterii, mykoplazm, pierwotniaków, grzybów chorobotwórczych i niektórych wirusów). Jest to czwartorzędowy związek amoniowy, który rozrywa błony komórkowe.

- Lizol - ciekłe mydło krezolowe (czyste krezole rozpuszczone w równej części w obojętnym mydle potasowym z oleju lnianego). Lizol jest środkiem dezynfekującym, niszczy formy wegetatywne bakterii, prątki gruŸlicy, wszy. Krezole są to trucizny protoplazmatyczne, które wchodzą w reakcje ze ścianą komórkową i białkami.

- H₂O₂ - nadtlenek wodoru wydziela zjonizowany tlen po zetknięciu z komórką i powoduje denaturację białek, uszkadza błonę cytoplazmatyczną i zlokalizowane w nie enzymy.

Zagadnienia.

Przygotowanie do pracy w laboratorium mikrobiologicznym. Wpływ czynników fizyko-chemicznych na bakterie:

Metody sterylizacji (rodzaje i mechanizmy działania); dezynfekcja - przykłady środków dezynfekcyjnych i sposób ich działania; czas i punkt śmierci cieplnej; Praca w warunkach jałowych - pojęcia: aseptyka, antyseptyka, sanityzacja. W jaki sposób sterylizuje się szkło laboratoryjne, pipety, narzędzia metalowe, podłoża bakteriologiczne itp...? Na czym polega i do czego służy dezynfekcja, przykłady środków dezynfekcyjnych i sposób ich działania), na czym polega działanie promieniowania ultrafioletowego, co to jest punkt oraz czas śmierci cieplnej.

Podłoża bakteriologiczne - do czego służą, jakie mikroorganizmy można hodować w warunkach in vitro Jakie warunki powinny spełniać pożywki mikrobiologiczne? Co to jest podłoże proste, wzbogacone, minimalne, wybiórcze, róznicujące (przykłady tych podłóż)? Przykłady czynników wybiórczych i różnicujących. Co to jest czysta kultura? do czego służy podłoże Chapmana? jaki to rodzaj podłoża? Co jest czynnikiem wybiórczym a co różnicującym w tym podłożu? Do czego służy podłoże MacConkeya? Jaki to rodzaj podłoża? Co jest czynnikiem wybiórczym i różnicującym? Jak odróżnić kolonie Escherichia coli od kolonii Salmonella sp. przy wykorzystaniu podłoża MacConkeya?

Ćwiczenie 4

Metody hodowli bakterii.

Metody hodowli bakterii - w podłożu płynnym, hodowla beztlenowców

Fizjologia mikroorganizmów.

Posiew na szereg biochemiczny- badanie właściwości biochemicznych wybranych pałeczek jelitowych

Morfologia kolonii bakteryjnych na różnych podłożach mikrobiologicznych.

Bakterie dnia rodzaj Salmonella, rodzaj Klebsiella

1. Hodowla E. coli na podłożu płynnym - wykreślanie krzywej wzrostu bakterii.

• Zaszczepić 1 ml hodowli nocnej E. coli w 50 ml pożywki płynnej. - dwie hodowle

• 1 Kolbę umieścić w wytrząsarce, w temperaturze 37^oC druga w temp. pokojowej na stole

• Bezpośrednio po zaszczepieniu bakterii oraz w odstępach czasowych co 20 minut wykonać pomiar OD₅₇₅ hodowli. Przed pomiarem kazda kolbke dobrze zamieszac.

• Na papierze milimetrowym wykreślić krzywą wzrostu bakterii (oś Y - OD; oś X - czas inkubacji).

• Wykonać seryjne rozcieńczenia z hodowli na poszczególnych etapach wzrostu (każda para próba pobrana w innym czasie) i określić ilość komórek bakteryjnych w poszczególnych fazach wzrostu (wysiewamy na murawę ostatnie 3 seryjne rozcieńczenia) na początku hodowli i na końcu hodowli w każdej grupie

2. Metody hodowli bakterii beztlenowych

W doświadczeniach prowadzona będzie hodowla bakterii beztlenowych z rodzaju Clostridium. Kontrolnie prowadzona będzie hodowla bakterii tlenowej, jaką jest Serratia marescens.

1. hodowla w próżni, z wykorzystaniem anaerostatu - DEMONSTRACJA