LABOLATORIUM Z BIOTECHNOLOGII

BIOSYNTEZA PROTEINAZ BAKTERYJNYCH

W FERMENTORACH

Polewczyk Arkadiusz

Kubacki Przemysław

Jerzewski Piotr

Data wykonania: 16 marca 2009 r.

Ochrona Środowiska

Grupa dziekańska II

Poniedziałek 16.15-20.00

WSTĘP

Proteinazy to hydrolazy peptydów rozszczepiające wiązania peptydowe wewnątrz cząsteczki polipeptydu. Stosuje się je najczęściej w przemyśle mleczarskim, rybnym, mięsnym, piwowarskim, koncentratów spożywczych, paszowym, jajczarskim, zbożowym i piekarniczym. Do badań użyta została proteinaza bakteryjna wyprodukowana przez szczep Bacillus subtilis, który podczas hodowli może produkować enzymy używane jako dodatek do proszków do prania oraz do otrzymywania hydrolizatów białkowych.

Hodowla enzymów bakteryjnych prowadzona jest w fermentorach zwanych inaczej bioreaktorami. Konstrukcje bioreaktorów są uwarunkowane przede wszystkim rodzajem drobnoustrojów stosowanych w procesie i jego wymaganiami fizjologicznymi, głównie zapotrzebowaniem na światło słoneczne, tlen, rodzaj pożywki, także rodzajem produktu końcowego oraz przyjętą metodą ich namnażania. Fermentor zbudowany jest ze stali kwasoodpornej, ma płaszcz grzejny, układ do pomiaru i regulacji temperatury, pH, układ napowietrzający i mieszający oraz układ do odpieniania. Pożywkę napowietrza się sterylnym powietrzem. Hodowla w bioreaktorze obejmuje następujące etapy:

- przygotowanie fermentora;

- przygotowanie i kontrolę osprzętu fermentora;

- przygotowanie pożywki lub podłoża, inokulum, odpieniaczy;

- sterylizację fermentora, pożywki, powietrza i pomieszczeń;

- wprowadzenie inokulum;

- fermentację i kontrolę parametrów procesu, jak: napowietrzanie mieszanie, ogrzewanie lub chłodzenie, odmienianie, poziom pH itp.;

- okresowe pobieranie próbek i ich kontrolę;

- opróżnianie zawartości fermentora;

- wydzielanie, oczyszczanie i otrzymywanie gotowego produktu;

- unieszkodliwianie produktów ubocznych lub odpadowych powstających w wyniku procesu.

W celu sterylizacji stosuje się metody mechaniczne (filtracja), środki chemiczne (formalina, tlenek etylenu), radiacyjne, ultradźwięki, termiczne. Sterylizacja może być przeprowadzona metodą ciągłą lub okresową.

SCHEMAT OGÓLNY BIOREAKTORA

WYKONANIE ĆWICZENIA

1. Oznaczenie aktywności proteinaz.

Aktywność proteolityczną oznaczono metodą Ansona. Jako białko została użyta hemoglobina zdenaturowana mocznikiem. Równolegle wykonano sześć prób właściwych i sześć kontrolnych. Do wszystkich probówek odmierzono po 1 ml hemoglobiny. W probówkach z próbami właściwymi umieszczono po 0,2 ml badanego enzymu kolejno po 24, 36, 48, 54, 62 i 72 godzinach hodowli, dokładnie i szybko wymieszano, a następnie prowadzono inkubację w temperaturze około 25⁰C w czasie wynoszącym ściśle 10 minut. Do probówek z próbami kontrolnymi, w których wcześniej umieszczono już hemoglobinę, odmierzono po 2 ml 5 % kwasu trójchlorooctowego (TCA), wymieszano i dodano po 0,2 ml roztworu badanego enzymu po kolejnych czasach hodowli. Po upływie 10 minut do prób właściwych szybko dodano po 2 ml 5 % TCA w celu zahamowania reakcji enzymatycznej. Wszystkie próby inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po tym czasie roztwory odfiltrowano przez sączki z bibuły. Pobrano po 1 ml supernatantów, dodano po 2 ml 0,6 N NaOH i 0,6 ml odczynnika Folina. Po 10 minutach od powstania zabarwienia zmierzono ekstynkcję przy długości fali 690 nm wobec prób kontrolnych. Wyniki zestawiono w poniższej tabeli.

Tabela 1. Oznaczenie aktywności proteinazy bakteryjnej.

Nr próby	Czas hodowli [h]	E690	A [μmol t./min*ml]
1	24	0,12	1,8
2	36	0,118	1,77
3	48	0,195	2,93
4	54	0,21	3,15
5	62	0,33	4,95
6	72	0,30	4,5

Obliczenie wyników:

A = K * E₆₉₀ * R [μmol tyrozyny/min*ml]

gdzie:

A - aktywność proteolityczna, [μmol tyrozyny/min*ml];

E₆₉₀ - ekstynkcja przy długości fali 690 nm wobec próby kontrolnej;

K - współczynnik z krzywej wzorcowej

K = 0,75;

R - rozcieńczenie

R = 20.

• Aktywność proteolityczna dla proteinazy po 24 godzinach hodowli:

A = 0,75 * 0,12 * 20 [μmol tyrozyny/min*ml]

A = 1,8 [μmol tyrozyny/min*ml]

Dla pozostałych czasów hodowli aktywność obliczono w analogiczny sposób. Wyniki przedstawiono w tabeli nr 1.

2. Oznaczenie zmętnienia.

W celu oznaczenia zmętnienia (stężenia biomasy) wykonano dwudziestokrotne rozcieńczenia cieczy po różnych czasach hodowli, kolejno po 24, 36. 48, 54, 62,72 godzinach. Po dokładnym wymieszaniu prób zmierzono ich ekstynkcję przy długości fali 660 nm wobec wody destylowanej. Wyniki pomiarów i wartości zmętnienia (po uwzględnieniu rozcieńczenia) cieczy po hodowli zestawiono w poniższej tabeli.

Tabela 2. Oznaczenie zmętnienia prób w zależności od czasu ich hodowli.

Nr próby	Czas hodowli [h]	E660	OD660
1	24	0,155		3,1
2	36	0,66		13,2
3	48	0,73		14,6
4	54	0,70		14
5	62	0,74		14,8
6	72	0,78		15,6

Poniższy wykres przedstawia zależność aktywności proteolitycznej oraz zmętnienia od czasu, w jakim prowadzona była hodowla szczepu produkującego badany enzym.

Rysunek 2. Dynamika biosyntezy proteinazy przez szczep Bacillus subtilis.

3. Zestawienie zbiorcze wyników grupy.

Nr próby	Czas hodowli [h]	I		II		III		IV
				A [μmol t./min*ml]	OD660	A [ μmol t./min*ml]	OD660	A [μmol t./min*ml]	OD660	A [μmol t./min*ml]	OD660
1	24	1,8	3,1	-	3	2,33	4,4	-	2
2	36	1,77	-	-	9,8	1,5	8,8	4,5	-
3	48	2,93	-	-	11	1,95	10,2	-	10,4
4	54	3,15	14	-	-	2,48	9	-	11
5	62	4,95	14,8	-	-	4,2	10,8	3,75	16
6	72	4,5	15,6	-	-	4,35	11	4,35	12,8

WNIOSKI:

Na podstawie wykresu stwierdzić można, że wprost proporcjonalnie z przyrostem biomasy wzrasta aktywność proteinaz, aż do 62 godziny prowadzenia procesu biosyntezy. Dalej aktywność enzymu zaczyna spadać. Wnioskować można, że optymalny czas produkcji proteinaz z wykorzystaniem szczepu Bacillus subtilis to 62 h (przy zachowaniu takich samych parametrów, jak w przeprowadzonym doświadczeniu tj.: skład pożywki, obroty mieszadła, napowietrzanie itp.).

Zmętnienie cieczy pohodowlanej wzrasta wraz z upływem czasu hodowli. Wynika z tego, że pomimo zmniejszającej się wydajności produkcji enzymu przez szczep Bacillus subtilis nadal ma miejsce wzrost biomasy tych drobnoustrojów.

Błędy pomiarowego mogą wynikać z niedokładności wykonujących analizę i przygotowujących próby do badań.

2

---