EGZAMIN TEORETYCZNO-PRAKTYCZNY

1. α-amylaza.

2. Hiperkalcemia.

3. Mikroalbuminuria.

4. Diagnostyka zaburzeń metabolizmu lipidów.

5. HbCO.

6. Fosfataza alkaliczna - AP, FA.

7. OGTT.

8. Test Schillinga.

9. Klirens kreatyniny.

10. TIBC.

11. Osady moczu.

12. RFLP.

13. Ogniskowanie izoelektryczne.

14. GGTP - oznaczanie, znaczenie diagnostyczne.

15. Test ksylozowy - wykonanie, znaczenie.

16. Test ciążowy.

17. Fosfor nieorganiczny - oznaczanie.

18. Immunodyfuzja radialna.

19. Obliczanie LDL - wzór Friedewalda.

20. Białkomocz - oznaczanie, przyczyny.

21. Metoda Kiejdahla.

22. AspAT - przeliczanie aktywności, przyczyny poziomu.

23. Czystość DNA - oznaczanie.

24. Hiper/hipourykemia i kwas moczowy.

25. Test optyczny z reakcją pomocniczą i wskaźnikową.

26. Test Kay'a.

27. LDH.

28. Immunoelektroforeza.

29. Amplifikacja.

30. Bilirubina w moczu - pochodzenie i metody oznaczania.

31. Prawidłowy proteinogram - metody oznaczania.

32. Test ksanturenowy.

33. PCR-SSCP.

34. PCR-HD.

35. Żółtaczka fizjologiczna.

36. HbA1c.

37. Białko C-reaktywne.

38. Mocznik - stężenie, przyczyny wzrostu w surowicy, znaczenie.

39. hCG.

40. Jan Kowalski.

41. Jednostki aktywności enzymów.

42. Metody wykrywania Helicobacter pylori.

43. Oznaczanie modyfikacji lipoprotein.

44. ELISA - wykrywanie antygenów, znaczniki i ich substraty.

45. Ostra porfiria przerywana.

46. Azot BUN.

47. Urobilina - pochodzenie i oznaczanie.

48. Historia testów ciążowych.

49. Wapń - przeliczanie stężeń, kalcemia.

50. HDL.

51. Żółtaczki wrodzone.

52. Pheochromocytoma.

53. Diagnostyka żółtaczki hemolitycznej.

54. Mocznik - metody wykrywania.

55. Białko Bence-Jonesa.

56. Metoda Drabkina.

57. Składniki moczu.

58. LPL.

59. α1-inhibitor proteaz.

60. Produkty peroksydacji i wolne rodniki.

61. Hiperfosfatemia.

62. Gammapatie - podział i charakterystyka, diagnostyka step-by-step.

63. DZM.

64. Diagnostyka gospodarki żelazowej.

65. Techniki przesiewowe wykrywania zmian nukleotydów - charakterystyka.

66. Metoda wychwytywania hormonów tarczycy przez żywice - wykonanie, interpretacja, zastosowanie.

67. Markery osoczowe zawału mięśnia sercowego - charakterystyka zmian aktywności.

68. Żółtaczka cholestatyczna - przyczyny, mechanizm zmian biochemicznych, diagnostyka step-by-step.

69. Metody izolowania DNA z krwi pełnej.

70. Metody izolowania białek z materiału biologicznego.

71. B12.

72. Glukozuria - definicja, podział, diagnostyka.

1. α-amylaza: Działanie α-amylazy polega na hydrolizie substratu - wielocukrów należących do α-glukanów - do dekstryn, następnie maltotrioz i maltoz. Hydroliza zachodzi do momentu, w którym amylaza zbliży się do rozgałęzienia cząsteczki cukrowca, powstają wówczas dekstryny graniczne enzym rozkłada wiązania α-1,4-glikozydowe i nie potrafi rozłożyć α-1,6-glikozydowych.

Enzym zawiera w centrum katalitycznym jony wapnia, które odpowiadają za stabilizację cząsteczki oraz za jego aktywną konformację. W związku z tym związanie jonów wapnia zahamuje aktywność α-amylazy EDTA (wersenian), cytrynian, szczawian, fluorki.

1. Występowanie: trzustka, ślinianki, wątroba, nerki, płuca, śledziona, mięśnie szkieletowe, serce, mózg. Śladowe ilości są stwierdzane we wszystkich tkankach. Największą aktywność amylazy wykazują sok trzustkowy i ślina, a dalej surowica i mocz.

2. Izoenzymy:

• Trzustkowe: P1, P2, P3

• Z gruczołów ślinowych: S1, S2, S3.

• Ze śluzówki jelita cienkiego: P2

• Z gruczołu mlecznego: P2, S1, S2

• Z komórek nabłonka Muellera jajników i jąder: O1, O2

Wędrują z γ-globulinami w czasie elektroforezy, mocz zawiera te same izoenzymy co surowica - głównymi są P i S w podobnych ilościach. U kobiet w czasie laktacji oraz przed menstruacją pojawia się w moczu izoenzym O₁.

3. Diagnostyka: Największe znaczenie diagnostyczne wykazują izoenzymy trzustkowe. Oznaczanie sprowadza się właściwie do diagnostyki chorób trzustki.

• Gwałtowny i bardzo wysoki wzrost aktywności α-amylazy w surowicy i moczu - Ostre zapalenie trzustki. Wartości maksymalne są osiągane po 20-30 godzinach od pierwszych objawów, normalizacja - po 4-10 dniach. Wzrost aktywności w moczu jest opóźniony w stosunku do krwi o ok. 6-10 godzin.

• Wzrost aktywności α-amylazy w surowicy i moczu połączony ze wzrostem aktywności lipazy w surowicy: Zatkanie przewodu trzustkowego lub żółciowego wspólnego, zaostrzenie przewlekłego zapalenia trzustki, urazy trzustki, ostry brzuch.

• Wzrost aktywności α-amylazy bez wzrostu lipazy: Zapalenie ślinianek, zapalenie przewodów śliniankowych, choroby jajników, jąder, nowotwory wydzielające ektopowo α-amylazę, leki: GKS, salicylany, sulfonamidy, tetracykliny.

• Wzrost w surowicy, spadek w moczu: Niewydolności nerek i makroamylazemia (wiązanie amylazy przez immunoglobuliny w większe kompleks, które nie mogą ulegać filtracji kłębuszkowej).

• Spadek aktywności α-amylazy w moczu i surowicy: Faza przewlekła przewlekłego zapalenia trzustki, mukowiscydozy, choroby przewlekłe wątroby, zatrucie barbituranami (ogólnie: znaczne uszkodzenie trzustki).

4. Metody oznaczania:

• Immunoinhibicja z wykorzystaniem przeciwciała hamujących aktywność konkretnych izoenzymów - stosowana do oznaczania izoenzymów trzustkowych.

• Metoda Caraway'a: polega na znoszeniu barwnej reakcji sacharydu z jodem. Jednostka Caraway'a to taka aktywność α-amylazy, która hydrolizuje 10 mg skrobi w ciągu 30 minut do stopnia, w którym ta reakcja zanika.

• EPS - substrat chroniony etylidyną: wykorzystuje się maltooligosacharydy o długości od 3 do 7 reszt glukozy, związane z p-nitrofenolem i glukozydazę. Substrat jest chroniony przed glukozydazą przez zablokowanie glukozy na końcu redukującym sacharydu mostkiem etylidenowym. W wyniku dopiero działania α-amylazy, może zadziałać glukozydaza, która wówczas uwolni barwny nitrofenol.

Norma:

• Surowica: 1,9-4,9 nkat/l, 60-160 j. C.

• Mocz: 1,9-9,8 nkat/l, 60-320 j. C.

2. Hiperkalcemia: Jest to stan, w którym stężenia wapnia całkowitego w surowicy krwi jest wyższe od 2,75 mmol/l czyli 11 mg%. Do przyczyn hiperkalcemii należą:

• Wzmożona mobilizacja wapnia z kości.

• Zwiększone wchłanianie z przewodu pokarmowego.

• Zmniejszone wydalanie wapnia z moczem.

• Współistnienie powyższych.

Hiperkalcemia jest obserwowana w przypadku:

• Nowotworów kości pierwotnych i przerzutowych, które stanowią 70% wszystkich przypadków hiperkalcemii.

• Pierwotnej nadczynności przytarczyc, wywołanych przerostem lub gruczolakiem przytarczyc - 20%.

• Guzów wydzielających PTH, czyli rak nerki, sutka, jajnika, pęcherza, trzustki, jelita grubego.

• Nowotworów układu krwiotwórczego: szpiczak, chłoniak, białaczki.

• Nadmiaru witaminy D.

• Hiperproteinemii.

• Sarkoidozy.

• Idiopatycznej hiperkalcemii noworodków.

• Wrodzonych niedoborach AP.

• Podawania leków: hydralazyny, tiazydów, zasadowych środków zobojętniających.

• Sporadycznie: gruźlicy, zespole Cushinga, czerwienicy, niewydolności krążenia, hiperwitaminozy A, po przeszczepie nerek.

3. Mikroalbuminuria: Jest to wydalanie albumin z moczem przekraczające 30 mg/dobę (20 mg/l), przy braku jawnego białkomoczu. Jest ona wczesnym wskaźnikiem rozwijającej się nefropatii cukrzycowej, jest także wykorzystywana do monitorowania nefropatii nadciśnieniowej i jako wskaźnik ogólnoustrojowego uszkodzenia śródbłonka naczyń - uogólnionego wzrostu przepuszczalności ściany naczyniowej dla makrocząsteczek. Mechanizm mikroalbuminurii w nefropatii cukrzycowej opiera się na glikowaniu składników błony podstawnej kłębuszka, co prowadzi do destrukcji elektroujemnej bariery filtracyjnej zapobiegającej przesączaniu białek o ujemnym ładunku cząsteczki uszkodzenie tej bariery pozwala na filtrację ujemnie naładowanych białek, np. albumin, które do tej pory nie były przepuszczane.

4. Diagnostyka zaburzeń metabolizmu lipidów: Diagnostyka gospodarki lipidowej przebiega według następującego algorytmu:

1. Czy istnieje hiperlipidemia? - Wykonujemy badania podstawowe - panel lipidowy (TCh, TG, HDL i LDL policzone, jeśli jest to możliwe, z wzoru Friedewalda). Hiperlipidemię stwierdza się przy TCh >200 mg/dl i/lub TG > 150 mg/dl.

2. Jaki to typ hiperlipidemii? - Bierzemy pod uwagę dwa podziały wg EAS, który wyróżnia hipercholesterolemię (TCh > 200 mg%), hipertriglicerydemię (TG > 150 mg%) i hiperlipidemię mieszaną (TCh > 200 mg%, TG > 150 mg%) oraz wg Fredricksona (tylko pierwotne), na 5 typów, dwoma podtypami.

3. Jaka jest przyczyna? - Żeby określić, czy przyczyna jest pierwotna czy wtórna, należy drogą eliminacji wykluczyć wszystkie wtórne, wg następującego algorytmu:

• Wywiad

• Badanie fizykalne

• Poziom TSH (subkliniczna forma niedoczynności jest czynnikiem ryzyka CHD)

• Poziom glukozy na czczo, połączone najlepiej z OGTT

• Poziom enzymów wątrobowych (AlAT, AspAT, LDH)

• Kreatynina, kwas moczowy, badanie osadu moczu

• Oznaczenie aktywności α-amylazy we krwi i moczu

• Stwierdzamy hiperlipidemię pierwotną.

1. Jakie są czynniki ryzyka i ryzyko globalne? - Przeprowadzamy wywiad w celu określenia pozalipidowych czynników ryzyka, do których należą: wiek, płeć, palenie papierosów, nadciśnienie, cukrzyca i wcześnie występująca choroba wieńcowa u krewnych pierwszego stopnia (u rodziców), nieprawidłowy WHR.

2. Jaki to typ prewencji? - Określamy, czy nasz pacjent będzie podlegał prewencji pierwotnej czy wtórnej. Wtórna wiąże się z występowaniem zdiagnozowanej CHD lub ekwiwalentów.

3. Jaki jest cel terapii? - Zależy od on typu prewencji, a także od dodatkowych czynników ryzyka. Docelowe stężenie cholesterolu LDL jest następujące:

• < 70 mg/dl - pacjenci o bardzo wysokim ryzyku, czyli ze zdiagnozowaną CHD i wieloma czynnikami ryzyka, poważnymi i słabo kontrolowanymi czynnikami ryzyka, np. paleniem, z zespołem metabolicznym, po przebyciu ostrego incydentu wieńcowego.

• < 100 mg/dl - pacjenci z CHD lub jej ekwiwalentami.

• < 130 mg/dl - 2 lub więcej czynnikami ryzyka, przy 10-letnim ryzyku wg Framingham poniżej 20%.

• < 160 mg/dl - pacjenci o 0 lub 1 czynniku ryzyka.

5. HbCO: Karboksyhemoglobina. Jest to hemoglobina związana z tlenkiem węgla, który ma kilkaset razy większe powinowactwo do Hb niż tlen. Połączenie hemu Hb z tlenkiem węgla blokuje możliwość przyłączania i transportu tlenu przez hemoglobinę. Toksyczność CO zależy od czasu ekspozycji i stężenia w środowisku. Fizjologiczna zawartość karboksyhemoglobiny nie przekracza 3% całkowitej hemoglobiny. Objawy zatrucia (głównie ból głowy i nudności) występują przy 20%, przy 60% - dochodzi do utraty świadomości i najczęściej do śmierci (70-80%). Karboksyhemoglobina ma kolor wiśniowoczerwony, co jest widoczne w skórze, łożyskach paznokci i błonach śluzowych pacjenta. Objawy przewlekłego działania subletalnych dawek CO to postępujące uszkodzenie mózgu i czasem stan przypominający parkinsonizm. Połączenie Hb z CO jest odwracalne - przy zatruciu tlenkiem węgla stosowana jest terapia HBO (hyperbaric oxygen) pobyt w komorach wysokociśnieniowych.

6. Fosfataza alkaliczna - AP: Fosfataza zasadowa hydrolizuje estry kwasu fosforowego, jest wysoce nieswoista dla substratu, a jej optimum pH wynosi 8,5-10.

1. Występowanie: Występuje w dużej ilości w tkance kostnej, w śluzówce jelita, łożysku, tkankach nowotworowych, nerkach i wątrobie. Jej lokalizacja subkomórkowa to jądro komórkowe, mitochondria, lizosomy i cytoplazma.

2. Izoenzymy: Wyróżniamy 4 izoenzymy: wątrobowy, kostny, łożyskowy i jelitowy. Można je oddzielić na podstawie ich różnych właściwości fizycznych i chemicznych:

CECHA	IZOENZYM (stopień hamowania)
		Kostny	Wątrobowy	Jelitowy	Łożyskowy
Rozpad na podjednostki w kwaśnym środowisku	++	+	+	+
Temperatura 56^oC	++ (po 5 minutach)	+ (po dłuższym czasie)	+ (po dłuższym czasie)	-
Wersenian sodu	+	+	+	-
Mocznik	++	++	+	-
Fenyloalanina	-	-	+	+
Ruchliwość elektroforetyczna pod wpływem neuraminidazy	↓	↓	N	↓

3. Diagnostyka: Fizjologiczny wzrost stężenia AP w surowicy obserwuje się u dzieci w okresie wzrostu w wyniku prawidłowego rozwoju kości, co powoduje fizjologiczne wzmożenie aktywności enzymów weń zaangażowanych oraz pod koniec ciąży, w wyniku produkcji izoenzymu łożyskowego. Normalizacja następuje po ok. 20 dniach po porodzie. W stanach patologicznych:

• AP należy do konstelacji cholestazy, wraz z LAP i GGTP, przez co jej wzrost będzie obserwowany w chorobach wątroby i dróg żółciowych przebiegających z zastojem żółci - żółtaczka zastoinowa, marskość zaporowa wątroby.

• Niektóre specyficzne izoenzymy AP są markerami nowotworowymi Regan, Nagao, Kashara i in. Są one związane z rakiem płuc, żołądka, wątroby, nerek i prostaty. Mają właściwości podobne do izoenzymu łożyskowego. Ich obecność zawsze jest związana z nowotworem, jednak ich brak nie świadczy o braku NPL.

• Izoenzym kostny jest markerem kościotworzenia, wraz z osteokalcyną. Jego wzrost u dorosłych może być objawem chorób przebiegających ze zniszczeniem i przebudową tkanki kostnej, np. torbielowatego włóknistego zapalenia kości w przebiegu nadczynności przytarczyc, zniekształcającego zapalenia kości, gruźlicy kości czy niedoboru witaminy D. Wzrost obserwuje się także przy długotrwałym unieruchomieniu.

7. OGTT: Doustny test obciążenia glukozą. Polega na zmierzeniu glikemii na czczo, a następnie po 2 godzinach od podania glukozy. Dawka glukozy wynosi 75g bezwodnej lub 82,5g jednowodnej glukozy w 250-300 ml wody, którą badany powinien wypić w ciągu pięciu minut. U dzieci dawka wynosi 1,75g glukozy na kg masy ciała do 75g. Po spożyciu roztworu glukozy pacjent pozostaje w spoczynku, w pozycji siedzącej. Przez 3 dni przed badaniem pacjent powinien spożywać normalną dietę, powyżej 150g węglowodanów na dobę i utrzymywać charakterystyczną dla siebie aktywność fizyczną. Na 8-14 godzin przed badaniem powinno się przestać jeść, można jednak pić wodę. Pacjent powinien na test zgłosić się rano, wypoczęty, po przespanej nocy. Podczas testu nie wolno palić.

Wskazania do testu:

1. cechy zespołu metabolicznego przy prawidłowej glikemii na czczo,

2. glikemia na czczo w zakresie 100-125 mg/dl (5,6-7 mmol/l),

3. glukozuria przy prawidłowej glikemii na czczo,

4. jako badanie diagnostyczne w rozpoznawaniu cukrzycy ciążowej.

Przeciwwskazania do testu:

1. rozpoznana wcześniej cukrzyca,

2. choroby przewodu pokarmowego mogące utrudniać przeprowadzenie testu, np. zespoły złego wchłaniania, stan po resekcji żołądka,

3. stany ostre (urazy, zawał mięśnia sercowego, infekcje),

4. stany znacznego niedożywienia,

5. zażywanie leków upośledzających tolerancję glukozy,

6. ciężki stan ogólny chorego,

7. glikemia na czczo wyższa lub równa 126 mg/dl.

Normy:

1. Na czczo:

• Prawidłowa glikemia: <100 mg/dl

• IFG: 100-125 mg/dl

• Cukrzyca: >125 mg/dl (>200 mg/dl bez potrzeby dalszej diagnostyki)

1. Po dwóch godzinach:

• Prawidłowa glikemia: <140 mg/dl

• IGT: 140-200 mg/dl

• Cukrzyca: >200 mg/dl

8. Test Schillinga: Służy do oceny stopnia wchłaniania witaminy B12 z przewodu pokarmowego, wykorzystując badanie radioaktywności moczu. Pozwala na określenie możliwej przyczyny niedoboru B12. Test składa się z dwóch części. W pierwszej pacjentowi podaje się (doustnie) małą dawkę - 1 ug znakowanej izotopowo B12. Po dwóch godzinach domięśniowo wstrzykuje się 1 mg B12 nie znakowanej. Część druga jest wykonywana po upływie 5 dni i polega na podaniu znakowanej B12 wraz z 60 mg świńskiego IF. Zafałszowanie wyników może wystąpić u osób z chorobami nerek.

Interpretacja wyniku:

1. Prawidłowe wchłanianie B12 charakteryzuje się ilością radioaktywnej B12 w DZM > 16% podanej dawki.

2. Mniejsza zawartość radioaktywnej B12 świadczy o jej upośledzonym wchłanianiu, które może być spowodowane:

• Niedoborem czynnika wewnętrznego IF, jeżeli dochodzi do normalizacji wyniku testu po przeprowadzeniu drugiej części.

• Przy braku normalizacji: polekowym złym wchłanianiem B12, niewydolnością trzustki, zespołem Zollingera-Ellisona, nieprawidłową florą bakteryjną.

9. Klirens kreatyniny: Jest to jednostka objętości osocza oczyszczona całkowicie z kreatyniny w jednostce czasu. Wyraża się go w ml/s lub ml/min. Wzrost klirensu będzie świadczył o zwiększonym stężeniu kreatyniny w osoczu, co prowadzi do zwiększonej sekrecji cewkowej. Klirens podaje się zwykle w formie znormalizowanej, czyli po przeliczeniu na powierzchnię ciała.

W celu oznaczenia klirensu kreatyniny należy zebrać DZM, pobrać krew pod koniec zbiórki moczu i oznaczyć stężenie kreatyniny w obu próbkach. Klirens oblicza się ze wzoru:

C u (mg/ml) x V u (ml) C u - stężenie kreatyniny w moczu

C cr = --------------------------------- C s - stężenie kreatyniny w surowicy

C s (mg/ml) x 1140 (min) V u - objętość moczu

Interpretacja klirensu jest możliwa, gdy badany ma w dłuższym czasie stałą masę mięśniową i dobowa zbiórka moczu jest bardzo dokładna, a mocz jest przechowywany w odpowiedniej temperaturze, gdyż wzrost temperatury powoduje wzmożoną konwersję kreatyny do kreatyniny, co może zafałszować wynik.

Zaniżone wyniki oznaczania klirensu kreatyniny występują przy niedokładnej dobowej zbiórce moczu, w obecności kwasu askorbinowego i przy białkomoczu.

Norma: 1 ml/s/m²

10. TIBC: TIBC=Total Iron Binding Capacity - jest to całkowita zdolność wiązania żelaza przez surowicę. To badanie pozwala określić maksymalną ilość żelaza, która może być przez nią związana. Zasada metody opiera się na tym, że prawidłowo transferyna jest wysycona żelazem w 30%, po dodaniu Fe do próbki możemy wysycić pozostałe 70%. Zaczynamy od oznaczenia stężenia żelaza w surowicy - to jest ta ilość, która wysyca 30% transferyny. Następnie dodajemy roztwór wysycający Fe, usuwamy nadmiar wolnych jonów Fe przez adsorpcję na węglanie magnezu i ponownie mierzymy zawartość żelaza w próbce - to jest TIBC. Odejmując od TIBC pierwszy wynik stężenia w surowicy otrzymujemy utajoną zdolność wiązania żelaza, odpowiadającą pozostałemu 70% wysycenia transferyny. Stężenie żelaza jest mierzone metodą kolorymetryczną z solą disodową kwasu batofenantrolino-disulfonowego, która daje w reakcji z jonami żelaza czerwony produkt.

Możliwe wyniki:

1. Fe ↑ TIBC ↓: Stężenie żelaza w surowicy rośnie, przez co utajona zdolność wiązania żelaza maleje, a tym samym maleje TIBC. Z taką sytuacją mamy do czynienia w przypadku hemolizy, megaloblastozy, uszkodzenia wątroby - w sytuacjach, kiedy z rozpadających się komórek, np.erytrocytów, hepatocytów uwalnia się żelazo.

2. Fe ↑ TIBC ↑: Taki wynik pojawia się w przypadku przyjmowania przez pacjentkę antykoncepcji hormonalnej bądź hormonalnej terapii zastępczej doustnie (!). Estrogeny w dużym stężeniu dostają się wówczas żyłą wrotną do wątroby i wywierają wpływ anaboliczny - dochodzi do wzmożonej biosyntezy białek, w tym właśnie transferyny.

3. Fe↓ TIBC↑: Stężenie żelaza spada, przez co rośnie utajona zdolność wiązania żelaza, a co za tym idzie - wzrasta TIBC. Takie wyniki są charakterystyczne dla niedoboru żelaza, spowodowanego głównie niewystarczającą podażą w diecie, a także przewlekłym krwawieniem, np. z przewodu pokarmowego i obfitymi miesiączkami.

4. Fe↓ TIBC↓: Jest to stan związany z istnieniem reakcji ostrofazowej - transferyna jest białkiem ujemnym ostrej fazy, przez co jej stężenie spada w APR, więc zmniejsza się również ATP. Żelazo w organizmie jest wyłapywane przez bakterie lub komórki nowotworowe, stąd jego stężenie również spada.

11. Osady moczu: Osady moczu ocenia się po umieszczeniu osadu, uzyskanego w wyniku odwirowania próbki moczu, na szkiełku podstawowym, nakryciu szkiełkiem nakrywkowym i obejrzeniu pod mikroskopem przy powiększeniu x400. W preparatach można zaobserwować składniki upostaciowane i nieupostaciowane:

1. Składniki zorganizowane:

• Komórki:

• Erytrocyty:

• Leukocyty:

• Nabłonki:

• Bakterie:

• Wałeczki prawdziwe:

• Szkliste:

• Ziarniste:

• Nabłonkowe:

• Woskowe:

• z erytrocytów

• Wałeczki rzekome:

• Z leukocytów:

• Z moczanów bezpostaciowych:

• Bakteryjne:

• Śluzowe:

1. Składniki niezorganizowane:

• Kryształy:

• W moczu o odczynie kwaśnym:

• Kwas moczowy:

• Szczawian wapnia:

• Dwuzasadowy fosforan wapniowy:

• Siarczan wapniowy:

• Kwas hipurowy:

• Cystyna:

• Leucyna:

• Tyrozyna:

• W moczu o odczynie obojętnym:

• Szczawian wapnia:

• Dwuzasadowy fosforan wapniowy:

• W moczu o odczynie zasadowym:

• Moczan amonowy:

• Szczawian wapnia:

• Węglan wapnia:

• Fosforan magnezu:

• Fosforan amonowo-magnezowy (trifosforan):

• Kryształy substancji zewnątrzpochodnych: kryształy sulfanilamidu, sulfatiazolu, sulfadiazyny:

• Cholesterolu:

• Bilirubiny:

• Hematoidyny:

• Kwasów tłuszczowych:

• Ksantyny:

• Ciała bezpostaciowe:

• Moczany bezpostaciowe w moczu obojętnym i kwaśnym:

• Fosforany bezpostaciowe w moczu zasadowym:

12. RFLP: RFLP - restricted fragment length polymorphism. Jest to metoda służąca do wykrywania znanych mutacji, wykorzystująca enzymy restrykcyjne umożliwia ona analizę sekwencji DNA poprzez analizę obecności/braku miejsc restrykcyjnych. Wykorzystywana jest głównie do wykrywania mutacji punktowych w genach. Ograniczeniem tej metody jest istnienie enzymu restrykcyjnego, który swoiście rozpoznaje badaną strukturę w genie dzikim lub zmutowanym, stąd nie wszystkie mutacje punktowe mogą być wykrywane tą techniką. W wyniku trawienia łańcucha DNA enzymami restrykcyjnymi otrzymujemy mieszaninę cząsteczek o różnych długościach, które można rozdzielić w czasie elektroforezy na żelu poliakrylamidowym lub agarozowym. Obecnie najczęściej stosuje się technikę PCR-RFLP, czyli badanie polimorfizmu fragmentów restrykcyjnych połączoną z łańcuchową reakcją polimerazy. Polega ona na amplifikacji fragmentu DNA (długość od kilku do kilkudziesięciu kbp) zawierającego miejsce restrykcyjne, na które działa wybrana restryktaza. W wyniku trawienia tych fragmentów, otrzymuje się tylko kilka fragmentów, wyraźnie różniących się długością, co umożliwia łatwą analizę w elektroforezie. Przykładem badania wykorzystującego metodę PCR-RFLP jest analiza polimorfizmu T174M - genu kodującego angiotensynogen.

13. Ogniskowanie izoelektryczne: Jest to metoda służąca do wyznaczania punktu izoelektrycznego pI białek. Rozdział prowadzi się w żelu, w którym poprzez zastosowanie amfolitów, czyli mieszaniny niskocząsteczkowych kwasów organicznych i zasad, został wytworzony ciągły gradient pH. Poszczególne białka wędrują dotąd, aż osiągną wartość pH odpowiadającą ich pI.

14. GGTP: γ-glutamylotranspeptydaza lub γ-glutamylotransferaza katalizuje reakcje przeniesienia grupy γ-glutamylowej z donora na odpowiedni akceptor. Produktami tej reakcji są mono, di, tri lub oligoglutamylowe peptydy.

1. Występowanie: GGTP występuje w wielu tkankach i płynach ustrojowych człowieka. Największą aktywność stwierdza się w nerce i jelicie, niższą w wątrobie, trzustce, mózgu, surowicy, żółci, PMR, leukocytach, ślinie i szpiku kostnym. W poziomie komórkowym, największą aktywność zbadano w błonach cytoplazmatycznych i komórkach stykających się z płynami ustrojowymi (krew, żółć, mocz pierwotny i sperma). W błonach GGTP występuje jako część wieloenzymatycznego kompleksu obok AP i 5'-NT. Zasadniczym źródłem GGTP w surowicy krwi jest wątroba!

2. Diagnostyka - wzrost aktywność GGTP obserwujemy przy:

1. GGTP należy do konstelacji cholestazy, czyli jej aktywność w surowicy wzrasta przy żółtaczce zastoinowej.

2. Ostre zapalenie wątroby: aktywność wzrasta późno w stosunku do enzymów indykatorowych i podniesione stężenie utrzymuje się znacznie dłużej - jest to prawdopodobnie odzwierciedlenie procesów regeneracyjnych wątroby.

3. Rak pierwotny i wtórny wątroby.

4. Toksyczne uszkodzenia wątroby: najwyższą aktywność stwierdza się u alkoholików z poalkoholowym stłuszczeniem lub marskością wątroby, podwyższenie - u pacjentów zażywających barbiturany, doustne środki antykoncepcyjne, chloropromazynę.

5. W przebiegu zawału mięśnia sercowego: wzrost aktywności rozpoczyna się 4 dnia od pojawienia objawów, osiąga maksimum w 2-3 tygodnie, w 4 tygodniu zaczyna maleć, a normalizacji ulega ok. 6 tygodnia. Przedłużające utrzymywanie się wysokiej aktywności GGTP u pacjentów po AMI może świadczyć o powikłaniu w postaci tętniaka serca.

6. RZS, ostre i przewlekłe zapalenie trzustki.

3. Metoda oznaczania: GGTP w obecności substratu - L-γ-glutamylo-4-nitroanilidu przenosi resztę γ-glutamylową na akceptor - glicyloglicynę, która równocześnie spełnia rolę aktywatora. W wyniku tej reakcji zostaje uwolniona żółto zabarwiona 4-nitroanilina. Intensywność zabarwienie jest wprost proporcjonalna do aktywności enzymu. Materiałem badanym jest surowica. Aktywność oznaczyć można metodą punktu końcowego lub kinetyczną.

4. Norma: 17-85 nkat/l lub 1-5 U/l

15. Test ksylozowy: Jest on odmianą testu obciążeniowego. Pacjentowi podaje się doustnie 25 g D-ksylozy, a następnie oznacza się zawartość tego cukru w pięciogodzinnej zbiórce moczu lub po 2 godzinach we krwi. W warunkach prawidłowych w zebranym moczu powinno się wydalić ok. 20% podanej dawki, czyli 4-5 g, a we krwi stężenie ksylozy powinno wynosić 20-52 mg%. O złym wchłanianiu świadczą wartości <3 g w moczu i <20 mg% we krwi. Test ksylozowy jest wykonywany w celu wykrycia zaburzeń wchłaniania i trawienia węglowodanów.

16. Test ciążowy: Domowy test ciążowy opiera się na metodzie immunochromatograficznej. W mini komorze chromatograficznej znajduje się pasek testowy, na którym w dwóch poziomych liniach są immobilizowane przeciwciała. Aby otrzymać wynik należy z zależności od testu zanurzyć końcówkę testera do naczynia z badanym moczem, przytrzymać końcówkę absorbującą testera w strumieniu oddawanego moczu lub umieścić kilka kropli moczu w przeznaczonym do tego okienku. Jeżeli w moczu znajduje się hCG, czyli jeśli kobieta jest w ciąży, to hormon ten wiąże się z monoklonalnym przeciwciałem anty-β-hCG sprzęgniętym z barwnikiem i przesuwa się na zasadzie efektu kapilarnego wzdłuż paska, uwidaczniając się w postaci barwnej poziomej linii na pasku. Przeciwciało nie związane z hCG zostaje zatrzymane na drugim prążku przeciwciał immobilizowanych do paska i uwidacznia się w postaci drugiej poziomej linii, będącej linią kontrolną, która świadczy o negatywnym wyniku testu dwie poziome linie - test dodatni, jedna linia - test ujemy, brak linii - złe wykonanie testu lub test wadliwy.

17. Fosfor nieorganiczny - oznaczanie: Fosfor oznacza się głównie metodami kolorymetrycznymi. Zasada polega na wytwarzaniu w środowisku kwaśnym z molibdenianem amonu tetratrimolibdenianofosforanu amonowego, który może być redukowany do błękitu molibdenowego o niebieskim zabarwieniu. Jako reduktory stosowane są chlorek cynawy, amidol i hydrochinon. Wyróżniamy dwie metody:

1. Fiske-Subbarowa: Reduktorem molibdenianofosforanu amonowego jest eikonogen, czyli kwas amno-2-naftolo-4-sulfonowy. Intensywność zabarwienia zależy od kwasowości roztworu, stąd wszystkie roztwory muszą mieć to samo pH. Przed wywołanie barwy należy zobojętnić próbkę roztworem amoniaku wobec p-nitrofenolu jako wskaźnika, do uzyskania żółtego zabarwienia.

2. Urbacha-Raabego: Fosforany tworzą z kwasem molibdenowym kwas fosforomolibdenowy, który pod wpływem o-hydrochinonu ulega rozłożeniu i redukcji do tlenku molibdenu o zabarwieniu niebieskim, zwanego błękitem molibdenowym.

18. Immunodyfuzja radialna: Metoda ta polega na tym, że surowicę badaną wprowadza się do dołeczka - studzienki wyciętej w żelu agarozowym, zawierającej surowicę monospecyficzną przeciwko antygenowi, którym jest badane białko surowicy. Antygen dyfundując do żelu wiąże się z cząsteczkami przeciwciał i w miejscu optymalnego stosunku stężeń antygenu do przeciwciał w miejscu, w którym antygen zostaje wysycony cząsteczkami przeciwciał, tworzy się pierścień precypitacyjny. Pomiędzy pierścieniem a miejscem dodania antygenu nie stwierdza się precypitacji, ponieważ antygen dyfundujący w tej przestrzeni jest w nadmiarze w stosunku do przeciwciała i tworzy z nim kompleksy rozpuszczalne. Średnica pierścienia precypitacyjnego jest proporcjonalna do stężenia antygenu. Pomiary wykonuje się zwykle po 24 godzinach dyfuzji odczytując stężenie badanego antygenu z krzywej standardowej.

19. Obliczanie LDL - wzór Friedewalda: Wzór Friedewalda pozwala na obliczenie stężenia LDLi mając podane stężenie cholesterolu całkowitego, triglicerydów oraz frakcji HDL. Ograniczeniem dla zastosowania tego wzoru jest stężenie triglicerydów przekraczające 450 (lub 400) mg%.

1. LDL (mmol/l) = TCh - HDL - (TG/2,2)

2. LDL (mg%) = TCh - HDL - (TG/5)

cholesterol 2.58 - 100 mg% tg 1.15 - 100 mg%

20. Białkomocz - oznaczanie, przyczyny: Białkomocz definiuje się jako wydalanie białka z moczem w stężeniu powyżej 500 mg/doba. Fizjologiczne dobowe wydalanie białka z moczem nie przekracza 150 mg. Białkomocz można podzielić:

1. Wg przyczyny:

1. Białkomocz kłębuszkowy - białkomocz spowodowany zwiększonym przesączaniem białek osocza w kłębuszkach spowodowane najczęściej uszkodzeniem błon granicznych.

• Selektywny - przesączeniu ulegają tylko niektóre małe białka, jak np. w mikroalbuminurii (nefropatia cukrzycowa) .

• Nieselektywny - przesączane są i małe, i duże białka większy stopień uszkodzenia błon.

1. Białkomocz kanalikowy - wywołany zmniejszonym wchłanianiem kanalikowym małocząsteczkowych białek osocza we wrodzonych lub nabytych zaburzeniach kanalikowych, najczęściej w ostrej niewydolności nerek.

2. Białkomocz wydzielniczy - w wyniku wydzielania do moczu białek wytwarzanych w kanalikach nerkowych.

1. Wg natężenia:

1. Białkomocz znikomy - do 500 mg/dobę.

2. Białkomocz mierny - od 0,5 do 3,5 g białka na dobę.

3. Białkomocz znaczny - powyżej 3,5 g na dobę.

Białko w moczu można oznaczyć metodami ilościowymi i jakościowymi:

1. Metody ilościowe oznaczania białka w moczu: Metodą referencyjną jest zmodyfikowana metoda Extona polegająca na turbidymetrycznej ocenie zmętnienia powstałego w wyniku reakcji z kwasem sulfosalicylowym i siarczanem sodu. Poza tym stosuje się metodę biuretową, opierającą się na tworzeniu kompleksu o barwie fioletowej między jonami miedzi a wiązaniem peptydowym.

2. Metody jakościowe oznaczania białka w moczu: Obecność białka w próbce wykrywa się odczynnikiem MacWilliamsa lub metodą termicznej denaturacji białka.

21. Metoda Kiejdahla: Umożliwia ilościowe oznaczenie azotu w próbce. W celu oznaczenia azotu zawartego w białkach należy badany materiał najpierw oczyścić od niebiałkowych związków azotowych. W pierwszym etapie przeprowadza się mineralizację związków organicznych przy udziale kwasu siarkowego w obecności katalizatora - miedzi, w wyniku czego powstaje z azotu zawartego w tych związkach siarczan amonu. Następnie pod wpływem stężonego NaOH z powstałego siarczanu amonu w aparacie destylacyjnym uwalniany jest amoniak - reakcja zachodzi w kolbie. Powstały amoniak dalej wiąże się z kwasem o określonym stężeniu, najczęściej z kwasem siarkowym lub solnym. Reakcja ta zachodzi w odbieralniku. Pozostałą niezwiązaną część kwasu oznacza się przez miareczkowanie zasadą sodową. Następnie oblicza się zawartość azotu w próbce, którą przelicza się na zawartość białka.

Czyste białka zawierają stałą ilość azotu, zwykle ok. 15-16% swojej masy. Oznaczoną ilość azotu mnoży się więc przez odpowiedni współczynnik - 6,25 dla zawartości azotu w białku 16%. Zawartość azotu w poszczególnych białkach jest różna i zależy od zawartości aminokwasów kwaśnych i zasadowych w białku => protaminy zawierają 30% azotu, a mucyny - 12%.

Metoda Kiejdahla jest metodą referencyjną przy standaryzacji innych metod ilościowego oznaczania białka.

22. AspAT i AlAT: Aminotransferaza asparaginianowa i aminotransferaza alaninowa (GOT i GPT). AspAT katalizuje reakcję przeniesienia grupy aminowej z aminokwasu asparaginianu na α-ketokwas z utworzeniem innego aminokwasu i szczawiooctanu, a AlAT transaminację alaniny do pirogronianu. Są to reakcje odwracalne. Należą one do transferaz i enzymów indykatorowych narządowo niespecyficznych. Jej koenzymem jest PLP.

1. Występowanie: W wielu narządach, najwięcej w wątrobie (tu przewaga AlAT) i w sercu (przewaga AspAT). Również w mięśniach, trzustce, śledzionie i płucach.

2. Izoenzymy: Wyróżniamy izoenzym cytoplazmatyczny, wędrujący z α-globulinami, który wytrąca się rivanolem i izoenzym mitochondrialny, wędrujący w elektroforezie z β2 i γ-globulinami.

3. Diagnostyka: Aspat jest nieswoistym markerem zawału mięśnia sercowego. Ogólnie, stężenie aminotransferaz wzrasta przy:

• Chorobach wątroby przebiegających z uszkodzeniem hepatocytów - WZW, toksyczne uszkodzenie wątroby, marskość, nowotwory.

• Zawale płuca, mózgu, nerki, śledziony i jelit.

• Chorobach mięśni - urazach, zapaleniach i dystrofiach.

• Ostrym zapaleniu trzustki i pęcherzyka żółciowego.

• Włośnicy, zabiegach kardiochirurgicznych, zapaleniu wsierdzia, gestozie, przełomie hemolitycznym, zespole zmiażdżenia, oparzeniu, naświetlaniu promieniami X, napadowej mioglobinurii i innych stanach patologicznych.

• Zażywaniu niektórych leków - GSK, erytromycyna, antykoncepcja hormonalna doustna, tetracykliny, morfina, kodeina, salicylany, glikozydy nasercowe.

Wykorzystuje się wskaźnik de Ritisa, czyli stosunek AspAT do AlAT prawidłowo przekracza nieco 1, przy ostrych schorzeniach wątroby - 0,6-0,7; w przewlekłych - często znacznie ponad 1.

1. Norma: dla obu <510 nkat/l lub <30 U/l

23. Oznaczanie czystości DNA: Można ją określić poprzez pomiar absorbancji światła UV. Przed pomiarem spektrofotometrycznym, preparaty powinny być rozcieńczone wodą destylowaną lub buforem TE. Po kalibracji odczytuje się wartość absorbancji dla wybranych długości fali. Dla oceny stopnia czystości DNA stosuje się oznaczenie stosunku A260/A280. Gdy stosunek ten wynosi 1,8-2 to preparaty są dobrze oczyszczone, jeśli jednak 1,5 to świadczy to o tym, że preparat zawiera 50% białek i 50% kwasów nukleinowych. Inną stosowaną metodą jest elektroforeza na żelu agarowym - jest to metoda z wyboru przy niewielkiej ilości preparatu. Po elektroforezie i wybarwieniu ocenia się jakość preparatu w transiluminatorze emitującym promieniowanie o długości fali 312 nm. Prawidłowo wyizolowany DNA w porównaniu z markerem wielkości jest widoczny w postaci zwartego prążka o wielkości ok. 50 kbp bez widocznych smug.

24. Hiper/hipourykemia i kwas moczowy:

1. Kwas moczowy: Kwas moczowy u ludzi jest produktem degradacji puryn, zgodnie z następującymi przemianami:

• Przebieg metabolizmu adenozyny:

• Deaminaza adenozynowa katalizuje przekształcenie adenozyny do inozyny, przy udziale wody, z uwolnieniem kationu amonowego.

• Fosforylaza rybonukleozydowa puryn prowadzi do przyłączenia reszty fosforanowej do inozyny i uwolnienia rybozo-1-fosforanu, z utworzeniem hipoksantyny.

• Oksydaza hipoksantynowa katalizuje przejście hipoksantyny do ksantyny, z równoczesnym utworzeniem nadtlenku wodoru. Wymaga obecności tlenu!

• Oksydaza ksantynowa prowadzi do przekształcenia ksantyny do kwasu moczowego, z wytworzeniem nadtlenku wodoru. Wymaga obecności tlenu!

• Przebieg metabolizmu guanozyny:

• Fosforylaza rybonukleozydowa puryn przeprowadza guanozynę w guaninę, z równoczesnym pobraniem reszty fosforanowej i uwolnieniem rybozo-1-fosforanu.

• Guanaza katalizuje przejście guaniny do ksantyny, z wydzieleniem amoniaku.

• Oksydaza ksantynowa prowadzi do przekształcenia ksantyny do kwasu moczowego, z wytworzeniem nadtlenku wodoru. Wymaga obecności tlenu!

1. Hiperurykemia: Jest to stan, w którym stężenie kwasu moczowego w surowicy wynosi ponad 7 mg%. Może mieć różne podłoże. Hiperurykemia może być:

• Spowodowana nadmiernym wytwarzaniem kwasu moczowego:

1. Zwiększona synteza puryn de novo:

• Zwiększone stężenie PRPP, spowodowane:

• podwyższoną aktywnością syntazy PRPP,

• amidotransferazą glutamylo-PRPP nie podlegającą regulacji przez IMP i GMP,

• zwiększonym 3-4 krotnie powinowactwem syntazy PRPP do rybozo-5-fosforanu (obniżenie Km).

• Choroba Lescha-Nyhana - niedobór fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej.

• Choroba von Gierkego - niedobór glukozo-6-fosfatazy powoduje, że większa ilość glukozo-6-fosforanu wchodzi do szlaku pentozofosforanowego, a co za tym idzie, powstaje więcej rybozo-5-fosforanu, co wzmaga syntezę puryn.

• Zwiększona aktywność reduktazy glutationowej erytrocytów z wtórną nadprodukcją rybozo-5-fosforanu.

• Wzmożone wytwarzanie puryn o nieznanym dotychczas patomechanizmie, przebiegające z prawidłową lub hiperurykozurią.

2. Zwiększony obrót komórkowy:

• Choroby rozrostowe szpiku i tkanki limfatycznej - czerwienice, białaczki szpikowe i limfatyczne.

• Niedokrwistość hemolityczna wywołana talasemią lub hemoglobinopatią S.

• Łuszczyca.

• Nadmierny rozpad komórek - zespół rozpadu nowotworów, hiperkatabolizm.

3. Nadmierna podaż puryn w diecie.

• Spowodowana upośledzonym wydalaniem kwasu moczowego przez nerki:

1. Upośledzone wydalanie kwasu moczowego przez cewki nerkowe:

• Pierwotny defekt cewek nerkowych.

• Polekowe hiperurykemie spowodowane lekami moczopędnymi, małymi dawkami kwasu acetylosalicylowego, pirazynamidem, etambutolem lub kwasem nikotynowym.

• Zatrucie solami ołowiu.

• Hiperurykemia wtórna do kwasicy mleczanowej lub ketonowej, nadczynności tarczycy, nad- i niedoczynności przytarczyc, cukrzycy, nadciśnienia samoistnego.

1. Zmniejszenie masy czynnego miąższu nerkowego:

• Przewlekła lub ostra niewydolność nerek.

• Zmniejszenie unaczynienia nerek.

1. Zmniejszenie wielkości przestrzeni wodnej pozakomórkowej.

Hiperurykemia, chociaż zwykle przebiega bezobjawowo, może dawać guzki dnawe i napady kolki nerkowej. U kilku procent pacjentów dojdzie do rozwoju dny moczanowej.

1. Hipourykemia: Stan charakteryzujący się obniżonym stężeniem kwasu moczowego we krwi, może być spowodowany niedoborem oksydazy ksantynowej lub podawaniem jej antagonistów.

25. Test optyczny z reakcją pomocniczą i wskaźnikową: Na teście optycznym (Warburga) opiera się wiele metod kinetycznych oznaczania aktywności enzymów. Polega ten test na badaniu pomiaru zmian absorpcji światła zredukowanej lub utlenionej formy koenzymów nikotynamidoadeninowych. Stosuje się go do oznaczania aktywności dehydrogenaz, których koenzymem jest NAD lub NADP, a także do pomiaru aktywności enzymów katalizujących reakcje sprzężone z dehydrogenazami, gdzie w końcowym etapie zachodzi utlenianie lub redukcja tych koenzymów. Test Warburga wykorzystuje zmiany właściwości optycznych koenzymu w czasie zmian stopnia utlenienia forma utleniona NAD (NADP) wykazuje maksimum absorpcji przy długości fali 260 nm. Jest ono zależne od obecności układu wiązań podwójnych w pierścieniu purynowym i pirymidynowym. Forma zredukowana wykazuje dodatkowe maksimum przy 340 nm, wynikające z zaniku układu aromatycznego i powstania układu dihydropirydyny => prędkość przechodzenia formy zredukowanej w utlenioną i odwrotnie można ustalić badając zmiany absorpcji przy długości fali 340 nm. Zmiany absorbancji w czasie są miarą szybkości reakcji, która w określonych warunkach jest proporcjonalna do aktywności enzymu. Wykorzystuje się również metody optyczne przy oznaczaniu aktywności dehydrogenaz zależnych od flawoprotein, które wykazują maksima przy długości 280, 380 i 450 nm. To ostatnie dla formy całkowicie zredukowanej zanika.

Wyróżnia się następujące odmiany testu optycznego:

1. Prosty: służy do oznaczania aktywności dehydrogenaz zależnych od NAD/NADP, np. do oznaczania aktywności LDH. Zmiany absorbancji przy długości fali 340 są wprost proporcjonalne do aktywności enzymu.

2. Z reakcją wskaźnikową: Obejmuje on dodatkowe reakcje wskaźnikowe katalizowane przez dehydrogenazy. Przykładem jest oznaczanie aktywności AlAT z wykorzystaniem LDH. Szybkość obniżania absorbancji przy 340 nm w tym przypadku zależy od powstawania NADH, która jest proporcjonalna do szybkości powstawania pirogronianu w reakcji katalizowanej przez aminotransferazę, co mówi o aktywności tego enzymu.

3. Z reakcją pomocniczą i wskaźnikową: Wykorzystywany np. do oznaczania aktywności kinazy kreatyninowej. W tym przypadku CK katalizuje powstawanie kreatyny i ATP z fosfokreatyny, następnie heksokinaza wykorzystuje ATP do wytworzenia glukozo-6-fosforanu, na który może zadziałać dehydrogenaza G6P zależna od NADP. Reakcją wskaźnikową jest tu reakcja katalizowana przez dehydrogenazę G6P, a pomocniczą - katalizowana przez heksokinazę.

26. Test Kay'a: Służy do oceny czynności wydzielniczej żołądka, jest powtarzalny a wyniki są porównywalne. Mówi on o wydzielaniu żołądka w warunkach podstawowych i maksymalnego pobudzenia. Oznacza się w nim trzy parametry: BAO - wydzielanie podstawowe, MAO - wydzielanie maksymalne, które jest wprost proporcjonalne do ilości sprawnych komórek okładzinowych, PAO - wydzielanie szczytowe.

Przed badaniem, pacjent powinien pozostawać na czczo przez 12 godzin i przez przynajmniej 48 godzin nie brać leków wpływających na czynność wydzielniczą żołądka. Test wykonuje się w godzinach porannych, ze względu na dobowy rytm wydzielania soku. Po założeniu pacjentowi sondy, odsysa się treść żołądkową, następnie przez godzinę co 15 minut odsysa się sok - te 4 frakcje dadzą BAO (ilość soku żołądkowego w mmol/h wydzielona przy braku jakiegokolwiek pobudzenia dla żołądka). Dalej podaje się środek pobudzający wydzielania, najlepiej pentagastrynę. Ponownie, co 15 minut odsysa się sok te 4 frakcje posłużą do wyliczenia PAO i oznaczenia MAO.

Wyniki uzyskuje się przez miareczkowanie 0,1-molowym r-rem NaOH wobec czerwieni fenolowej. PAO liczy się poprzez pomnożenie przez 2 sumy dwóch najwyższych sąsiadujących frakcji MAO.

Wyniki prawidłowe to BAO do 5 mmol/h a MAO - 5-25 mmol/h. Wartości obniżone świadczą o zaniku śluzówki żołądka, a wysokie spotyka się w chorobie wrzodowej dwunastnicy. Stosunek BAO/MAO, przy znanych wartościach MAO i BAO może służyć do diagnostyki zespołu Zollingera-Ellisona prawidłowo stosunek ten nie przekracza 0,43, w rozwiniętej chorobie jest wyższy niż 0,6. Wartość 0,43-0,6 nasuwa podejrzenie tego schorzenia.

27. LDH: Należy do oksydoreduktaz i enzymów indykatorowych narządowo niespecyficznych. Katalizuje odwracalną przemianę kwasu pirogronowego do mleczanu i kończy glikolizę w warunkach beztlenowych.

1. Występowanie: Jest enzymem cytoplazmatycznym. Występuje we wszystkich tkankach, ale największą aktywność wykazuje w wątrobie oraz mięśniach szkieletowych, nerkach, sercu i płucach.

2. Izoenzymy: Wyróżniamy 5 izoenzymów, które w elektroforezie wędrują z globulinami - LDH1 z α1, LDH2 z α2, LDH3 z β, LDH4 z szybkimi γ i LDH5 z wolnymi γ. Są to tetramery zbudowane z dwóch rodzajów podjednostek - H i M. Oba łańcuchy mają podobną masę cząsteczkową i zbliżone właściwości antygenowe, ale różnią się składem aminokwasowym i właściwościami kinetycznymi - wrażliwością na hamowanie przez pirogronian - oraz swoistością substratową - H katalizuje również przemianę α-ketomaślanu w α-hydroksymaślan. Izoenzymy bogate w H - 1 i 2 występują w tkankach, w których intensywnie zachodzą przemiany oksydacyjne (serce, mózg, nerki), a te, w których zachodzą przemiany beztlenowe zawierają 4 i 5 (wątroba, mięśnie). W surowicy największą aktywność wykazuje 2, dalej 1 i 3. 4 i 5 pojawiają się głównie w warunkach patologicznych.

3. Diagnostyka: Największe znaczenie kliniczne ma dehydrogenaza β-hydroksymaślanowa, czyli frakcje LDH1 i LDH2, która jest markerem zawału mięśnia sercowego, jego aktywność zwiększa się również w chorobach wątroby. Wzrost aktywności LDH w surowicy obserwuje się w nowotworach, w tym w białaczkach (LDH3), zapaleniach i zawale płuc, niedokrwistościach megaloblastycznych i postępującej dystrofii mięśniowej.

4. Metody oznaczania: Izoenzymy rozdziela się metodami immunologicznymi i chromatograficznymi. Frakcje 3-5 są inaktywowane przez wysoką temperaturę, 5 wytrąca się acetonem i nie wytrąca rivanolem, a 1 odwrotnie. Dodatkowo wolno wędrujące LDH są hamowane przez mocznik, a szybsze - przez szczawiany. Aktywność enzymu można oznaczyć stosując test optyczny prosty.

5. Norma: 1200-3500 nkat/l lub 70-200 U/l

28. Immunoeletroforeza: Polega na elektroforetycznym rozdziale białka badanego, a następnie immunodyfuzji surowicy odpornościowej. Pozwala na równoczesne oznaczenie jakościowe i półilościowe wielu białek (w zależności od stosowanych immunosurowic). W diagnostyce stosowana jest do identyfikacji białek monoklonalnych oraz wykrywania niedoborów odpornościowych. Materiałem może być surowica bez śladu hemolizy świeża lub przechowywana w temperaturze -20 st. C.; mocz świeży lub z DZM; PMR.

1. Postępowanie:

• Przygotowanie szkiełek podstawowych i nałożenie agaru.

• Wycięcie otworów w agarze.

• Przygotowanie materiału badanego - surowice należy rozcieńczyć, a mocz zagęścić.

• Elektroforeza.

• Immunodyfuzja.

• Wyciąć rowki w agarze.

• Barwienie precypitatu antygen-przeciwciało odpowiednim barwnikiem.

• Ocena rozdziału na podstawie atlasu białek.

1. Interpretacja wyników: Wynik interpretuje się uwzględniając dodatkowo stężenie białka całkowitego w surowicy, elektroforezę białka, obraz krwi obwodowej, dane kliniczne pacjenta.

29. Amplifikacja: Amplifikacja DNA techniką reakcji łańcuchowej polimerazy służy do powielania materiału genetycznego o wielkości do 2 kbp, a czasem większych fragmentów, metodą enzymatyczną. Umożliwia powielenie in vitro wybranych fragmentów DNA i RNA uprzednio przepisanych na cDNA. Jest ona alternatywą do klonowania i może być używana do amplifikacji bardzo rzadkich sekwencji w mieszaninie, ale pod warunkiem, że znana jest sekwencja otaczająca fragment. Jej zaletą jest możliwość wykorzystania do reakcji DNA w znacznym stopniu zdegradowanego, jeśli tylko degradacja ta nie dotyczy amplifikowanej sekwencji. Technika ta naśladuje zjawisko replikacji DNA i polega na enzymatycznej amplifikacji wybranych fragmentów DNA, za pomocą termostabilnej polimerazy. Zespół enzymów, które in vivo przygotowywują matrycę do replikacji DNA, zostaje zastąpiony termiczną denaturacją DNA, natomiast działanie primosomu i synteza starterów są zastąpione syntetycznym oligonukleotydem komplementarnym do 3'-końca wybranego regionu matrycy.

Metoda PCR polega na cyklicznym powtarzaniu denaturacji cząsteczki DNA, przyłączeniu starterów do jednoniciowej matrycy i syntezie nowej nici pomiędzy tymi starterami przy udziale termostabilnej polimerazy DNA. Przeprowadzą się ją w termocyklerach. W każdym cyklu liczba kopii sekwencji między primerami rośnie wykładniczo.

Przebieg:

1. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej, która zawiera matrycę DNA lub RNA, dNTP służące jako substraty reakcji dla polimerazy i dostarczające energii do jej przebiegu, termostabilną polimerazę, bufor, syntetyczne oligonukleotydy - startery o długości ok. 20 nukleotydów, komplementerne do 3'-końca obu nici DNA. Startery przyłączają się do komplementarnego odcinka DNA wyznaczając fragment, który ma być powielony. Startery dodawane są w dużym nadmiarze molowym w stosunku do zdenaturowanego DNA.

2. DNA jest denaturowany termicznie w temperaturze 92-94 stopni.

3. Temperaturę obniża się do 40-60 stopni, co powoduje łączenie się primerów z komplementarnymi odcinkami DNA - matrycą. Służą one jako startery dla termostabilnej polimerazy DNA. Termperatura przyłączania starterów jest uzależniona od rodzaju zasad wchodzących w ich skład. Niższe temperatury renaturacji mogą powodować niespecyficzne łączenie matrycy ze starterem.

4. Synteza nowej nici w temperaturze 72 stopni.

5. Podgrzanie celem dysocjacji nowo powstałych dwuniciowych fragmentów i powtórzenie cyklu.

30. Bilirubina w moczu - pochodzenie i metody oznaczania: W warunkach prawidłowych w moczu znaleźć możemy jedynie urobilinę, obecność bilirubiny jest stanem patologicznym. Pojawia się tam ona w wyniku przeciekania bilirubiny sprzężonej z wątroby do krążenia systemowego spowodowanego cholestazą lub uszkodzeniem bieguna wydzielniczego hepatocytu. Bilirubinę w moczu oznacza się wyłącznie jakościowo przy pomocy testów paskowych.

31. Prawidłowy proteinogram - metody oznaczania: Prawidłowy proteinogram ma wartości:

FRAKCJA	STĘŻENIE (%)
albuminy	-	50-67
globuliny	α1	2-5
		α2	6-13
		β	9-14
		γ	8-21

Proteinogram wykonuje się zwykle metodą elektroforetyczną. Najczęściej przeprowadza się ją w buforze o pH 8,6 - w tym pH białka wykazują w większości ładunek ujemy i wędrują w kierunku anody (+). Białka różnią się ruchliwością elektroforetyczną, gdyż posiadają różną ilość zdysocjowanych grup karboksylowych. Na rozdział wpływają: ładunek elektryczny i wielkość cząsteczek białkowych, pH, siła jonowa bufory, rodzaj nośnika najlepsze właściwości rozdzielcze i krótszy czas rozdziału mają octan celulozy i żel agarozowy. Warunki dobiera się tak, by otrzymać niewielką liczbę dobrze oddzielonych frakcji. Po wykonaniu rozdziału, żel wybarwia się odpowiednim barwnikiem charakterystycznym dla białek, np. czernią amidową i oznacza się procentową zawartość poszczególnych frakcji białkowych. Obraz elektroforetyczny pozwala na zdiagnozowanie zaburzeń w gospodarce białkowej - dysproteinemiii i paraproteinemii..

32. Test ksanturenowy: Służy do oceny poziomu witaminy B6 w organizmie. Opiera się na katabolizmie tryptofanu, w którym bierze udział ta witamina, jako koenzym kinureninazy. W stanach niedoboru B6 dochodzi do zaburzenia przemian metabolicznych, w wyniku których powstaje kwas ksanturenowy, wydalany z moczem.

1. Przemiany: Pod wpływem dioksygenazy tryptofanowej L-tryptofan przechodzi w formylokinureninę, która jest przekształcana przez formamidazę do L-kinureniny. Może być ona przekształcana do kwasu kinureninowego lub, pod wpływem monooksygenazy kinureninowej, do 3-L-hydroksykinureniny. W obecności PLP, działa kinureninaza i powstaje hydroksyantranilan, który może być rozłożony do wody i dwutlenku węgla. Przy niedoborze - hydroksykinurenina rozpada się na kwas ksanturenowy i amoniak.

2. Wykonanie testu: Pacjentowi z podejrzeniem niedoboru witaminy B6 podaje się 10 g tryptofanu w 0,25 l wody. Stężenie kwasu ksanturenowego oznacza się w DZM.

3. Interpretacja wyniku: Przy prawidłowym stężeniu B6 w organizmie kwas ksanturenowy nie powstaje lub zawiera się w granicach błędu metody. Po obciążeniu aminokwasem, dobowe wydalanie kwasu może wynosić ok. 20 mg. Wydalanie powyżej 50 mg świadczy o niedoborze witaminy. Test ten jest mało swoisty i nawet wyniki w normie nie stanowią pewnego dowodu prawidłowej zawartości witaminy B6 w organizmie.

33. PCR-SSCP: Analiza polimorfizmu jednoniciowych fragmentów DNA, umożliwia wykrycie nieznanych mutacji. Analizę prowadzi się na produktach reakcji PCR, które przed elektroforezą denaturuje się termicznie w buforze obciążającym z dodatkiem formamidu, a następnie rozdziela się na natywnym żelu poliakrylamidowym jednoniciowe fragmenty DNA, które podczas elektroforezy przyjęły strukturę II i III-rzędową zależną od ich sekwencji nukleotydowej. Nawet zmiany pojedynczych nukleotydów mogą się odbić na konformacji cząsteczki, a tym samym zmienić prędkość migracji w żelu w stosunku do fragmentów prawidłowych.

34. PCR-HD: Umożliwia wykrycie heterodupleksów DNA:DNA między zmutowanym DNA a DNA typu dzikiego. Przed rozdziałem elektroforetycznym przeprowadza się denaturację cieplną badanego DNA, a następnie obniża temperaturą mieszaniny. Jednoniciowe cząsteczki łączą się zgodnie z zasadą komplementarności. Ewentualny brak parowania w analizowanym dwuniciowym fragmencie DNA (czyli różnica między DNA dzikim a DNA badanym) zmienia strukturę i kształt cząsteczek. Powstałe tzw. heterodupleksy w natywnym żelu poliakrylamidowym migrują z inną szybkością niż homodupleksy.

35. Żółtaczka fizjologiczna: Hiperbilirubinemia noworodków jest stanem fizjologicznym, jest to zwiększenie stężenia bilirubiny wolnej w pierwszych 7-10 dniach życia. Zwiększenie to osiąga wartość szczytową w dniu siódmym, a następnie zmniejsza się do wartości prawidłowych na początku trzeciego tygodnia życia. Stan ten jest spowodowany upośledzoną koniugacją bilirubiny przez niedojrzały jeszcze aparat gładkiej siateczki śródplazmatycznej, a także niedostatecznym wychwytem bilirubiny przez białka receptorowe hepatocytów oraz niedostatecznie sprawnym wydzielaniem barwnika na biegunie żółciowym hepatocytów. Stan ten nie wymaga leczenia. Dopiero przedłużająca się żółtaczka, spowodowana np. wrodzonymi wadami dróg żółciowych lub niedoborem enzymatycznym powinna być leczona (fenobarbital i naświetlanie), gdyż w przeciwnym przypadku może prowadzić do wystąpienia objawów kernicterus skurcze spastyczne mięśni, niedorozwój umysłowy.

36. HbA-1c: Hemoglobina glikowana, powstaje w wyniku nieenzymatycznego przyłączenia glukozy do hemoglobiny. Jest wykorzystywana jako wskaźnik wyrównania cukrzycy - informuje o poziomie glikemii przez 120 dni poprzedzających badanie długość życia erytrocytów. Marker ten można wykorzystywać jeśli u pacjenta nie występują nieprawidłowe hemoglobiny, czas życia erytrocytów jest prawidłowy, używany test jest odpowiednio wystandardyzowany. Zaleca się oznaczanie HbA-1c przynajmniej dwa razy w roku u pacjentów z rozpoznaną cukrzycą i co najmniej cztery u leczonych insuliną. Jej stężenie jest również silnym predyktorem rozwoju komplikacji cukrzycowych nefropatia, retinopatia, choroby układu krążenia, neuropatia, udary. Wraz z obniżaniem się stężenia tego markera maleje ryzyko tych powikłań.

Stosuje się wiele metod pomiaru HbA-1c, których wyniki nie są porównywalne, dlatego powinno się stosować zawsze tą samą metodę, a badanie najlepiej przeprowadzać w tym samym laboratorium. Wyniki odzwierciedlają średnią glikemię przez okres 3 miesięcy, ale nie mówi nic o stabilizacji bądź wahaniach glikemii. Dlatego pomocnym badaniem jest profil dobowy glikemii.

Normy: </= 6,5% - małe ryzyko powikłań, >6,5 - ryzyko miażdżycy, >7,5 - ryzyko mikroangiopatii

37. Białko C-reaktywne: Jest to jedno z najważniejszych białek ostrofazowych, jego nazwa pochodzi od zdolności wiązania się z polisacharydem C ściany komórkowej dwoinki zapalenia płuc. Jego stężenie w surowicy wzrasta w wyniku zakażeń bakteryjnych, w rozległych urazach, oparzeniach, chorobach nowotworowych i martwicach narządowych. Wzrost stężeniach następuje 12-24 godzin od uszkodzenia, osiągając maksimum, nawet 2000 razy wyższe od stężenia wyjściowego, w 48 godzinie. Do normalizacji dochodzi po 2-3 tygodniach. CRP prócz wiązania się z polisacharydem bakterii wiąże się z fosfolipidami, a zwłaszcza z lecytyną, a prócz tego z kwasami nukleinowymi i w środowisku pozbawionym Ca - z histonami. Do funkcji CRP należą:

1. Wiązanie się ze składnikami dopełniacza i aktywacja drogi klasycznej.

2. Usuwanie toksycznych substancji powstałych w czasie uszkodzenia tkanek.

3. Aktywacja makrofagów.

Fizjologiczne stężenie w osoczu wynosi 0-10 mg/l.

Oznaczanie CRP metodą wysokoczułą jest jednym z predyktorów rozwoju choroby wieńcowej.

38. Mocznik - stężenie, przyczyny wzrostu w surowicy, znaczenie:

1. Stężenie: 2,5-6,5 mmol/l lub 15-40 mg%, stanowi 45% azotu pozabiałkowego.

2. Przyczyny zmian stężenia w surowicy:

• Wzrost stężenia:

• Upośledzenie filtracji kłębkowej - ostra niewydolność nerek lub przewlekłe choroby nerek.

• Zmniejszony przepływ krwi przez nerki - wstrząs lub zastoinowa niewydolności krążenia.

• Zwiększony katabolizm białek - dieta wysokobiałkowa, utrata masy mięśniowej, reabsorpcja białek po krwawieniu z przewodu pokarmowego, sterydoterapia, gorączka, nadczynność tarczycy.

• Po podaniu leków - antybiotyki nefrotoksyczne, indometacyna, metyldopa.

• Odwodnienie.

• Spadek stężenia:

• Ciężkie choroby wątroby - zatrucie CCl4, chloroformem, ostry żółty zanik wątroby, WZW.

• Androgenoterapia.

• Dieta niskobiałkowa.

• Głodzenie.

• Przewodnienie.

1. Znaczenie: Powstawanie mocznika jest główną drogą usuwania toksycznego amoniaku z organizmu. Jest on całkowicie przesączany w nerkach.

39. Ludzka gonadotropina kosmówkowa - hCG:

1. Budowa: Jest to glikoproteina zbudowana z podjednostki α i β. Sekwencja podjednostki α jest podobna po sekwencji podjednostek innych hormonów - luteotropina, folikulotropina i tyreotropina. Sekwencja podjednostki β jest całkowicie swoista dla hCG. Podobieństwo strukturalne związków chemicznych oznaczanych metodami immunologicznymi stwarza niebezpieczeństwo zajścia reakcji krzyżowej ważna jest duża swoistość przeciwciał stosowanych do oznaczenia hCG, szczególnie ze względu na duże podobieństwo do LH, który jest obecny w wysokim stężeniu w okresie owulacji i przekwitania u kobiet.

2. Rola: Stymuluje ciałko żółte ciążowe do produkcji hormonów sterydowych, w tym głównie progesteronu, do momentu przejęcia roli wydzielniczej przez łożysko a co za tym idzie, wysoki poziom hCG jest konieczny do podtrzymania ciąży. Jest również prawdopodobnie stymulatorem nadnerczy płodu i działa tyreotropowo.

3. Znaczenie: hCG wykorzystuje się do wykrywania wczesnej ciąży, już 7-10 dni po zapłodnieniu. Markerem ciąży we wczesnym okresie jest stężenie hCG powyżej 25 mU/ml lub podwojenie jej stężenia w ciągu 3 dni. Jest również stosowana do monitorowania przebiegu ciąży, monitorowania leczenia oraz prognozowania losów ciąży w przypadku poronień zagrażających lub nawykowych brak wzrostu i/lub zmniejszanie się stężenia hCG w kolejnych badaniach wskazuje na obumieranie ciąży. Można również wykorzystywać stosunek stężenia podjednostki α do β α wzrasta bez przerwy aż do porodu, natomiast β, jak i ogólne stężenie hCG zaczyna spadać około 13 tygodnia ciąży. W ciąży prawidłowej w pierwszym trymestrze α/β > 2, a w trzecim - >10. Stosunek α do β poniżej 2 świadczy o poronieniu zagrażającym. Poziom hCG ma także znaczenie w diagnostyce i kontroli leczenia zaśniadu groniastego i nabłoniaka kosmówki, a także niektórych nowotworów - jajnika, szyjki macicy, jąder. Zwiększone jej stężenie może również być znakiem występowania nowotworu ektopowo wydzielającego ten hormon.

4. Test potrójny: hCG wchodzi w skład testu potrójnego wykonywanego w surowicy kobiet między 14 a 21 tygodniem ciąży w przypadku podejrzenia wad rozwojowych OUN płodu lub trisomii 21. Oznacza się, prócz hCG, α-fetoproteinę i wolny estriol. Na podstawie tych stężeń wyliczany jest wskaźnik. Przekroczenie pewnej wartości krytycznej pozwala na zdiagnozowanie z 55-65% zespół Downa. Bardziej wydajny jest test PAPP-A, w którym dodatkowo oznacza się białko osoczowe A związane z ciążą i β-hCG. Test ten jest skuteczny w 85-90% przypadków.

40. Jan Kowalski:

41. Jednostki aktywności enzymów:

1. Międzynarodowa jednostka standardowa enzymu (U/IU): jest to taka ilość enzymu, która katalizuje przemianę jednego mikromola substratu lub 1 mikromola grup chemicznych w ciągu minuty w temperaturze 30 stopni, w optymalnych warunkach reakcji przy stężeniu substratu gwarantującym pełne wysycenie enzymu. Miarą IU jest μmol/min.

2. Stężenie aktywności enzymatycznej w roztworze: Przeliczenie stężenia aktywności enzymatycznej na 1 l przy oznaczeniu aktywności enzymu w płynach biologicznych.

3. Aktywność właściwa: określa stopień czystości preparatów enzymatycznych, jest wyrażona w IU/mg - liczba jednostek standardowych przypadających na miligram białka. Może być również wyrażana w μkat/kg białka.

4. Aktywność molekularna: określa reaktywność enzymu, jest to liczba cząsteczek substratu przekształconych w produkty w czasie 1 minuty przez 1 cząsteczkę enzymu w optymalnych warunkach.

5. Katal: jest to aktywność, która przekształca jeden mol substratu w czasie 1 sekundy w optymalnych warunkach reakcji przy stężeniu substratu gwarantującym pełne wysycenie enzymu; mianem jest mol/s.

6. Aktywność molarna: Wyrażona w katalach na mol enzymu.

Dodatkowo wyróżniamy: jednostkę aktywności Bodansky'ego, która mówi o aktywności fosfataz, jednostkę Kinga-Armstronga, która również służy do określania aktywności fosfataz oraz jednostkę Caraway'a dotyczącą α-amylazy.

42. Metody wykrywania Helicobacter pylori: Helicobacter pylori jest bakterią kolonizującą błonę śluzową żołądka człowieka. Wywiera ona szkodliwy wpływ na ochronną barierę śluzową i samą śluzówkę. Jej obecność w żołądku zwiększa ryzyko rozwoju choroby wrzodowej dwunastnicy, żołądka, zapalenia błony śluzowej i niektórych nowotworów żołądka. Istnieją dwa rodzaje metod wykrywania H. pylori:

1. Metody inwazyjne: Polegają na pobraniu w trakcie gastroskopii wycinka błony śluzowej żołądka i jego dalszym badaniu poprzez:

• Szybki test ureazowy: polega on na stwierdzeniu obecności ureazy w wycinku żołądka, która przekształca mocznik do dwutlenku węgla i amoniaku. Wycinek umieszcza się na krążku bibuły i zwilża kilkoma kroplami wody destylowanej. Bibuła zawiera mocznik i wskaźnik barwny, który w przypadku alkalizacji środowiska zmieni barwę z żółtej na czerwoną. Jeżeli bakterie są obecne, dojdzie do wydzielenia amoniaku, który w środowisku wodnym doprowadzi do powstania jonu amonowego i wodorotlenkowego, co spowoduje wzrost pH i zmianę barwy.

• Hodowlę bakteryjną.

• Wykrywanie materiału genetycznego bakterii poprzez PCR.

• Stwierdzenie obecności spiralnych bakterii w badaniu histopatologicznym.

1. Metody nieinwazyjne: Nie wymagają one wykonania gastroskopii.

• Testy oddechowe: polegają na podaniu pacjentowi drogą doustną mocznika znakowanego izotopowo. Jeśli w żołądku obecna jest Helicobacter pylori, dojdzie do rozkładu mocznika, a dwutlenek węgla znakowany radioaktywnie zostanie usunięty wraz z wydychanym powietrzem przez płuca. Wykrycie izotopu 14-C przy pomocy licznika scyntylacyjnego w tym powietrzu daje dodatni wynik testu. Można również stosować nie radioaktywny izotop 13-C, który wówczas wykrywa się metodami spektrometrii masowej, spektrometrii w podczerwieni oraz spektrometrii laserowej.

• Metody immunologiczne: polegają na wykryciu we krwi pacjenta przeciwciał IgG skierowanych przeciw antygenom bakterii. Ich przydatność jest ograniczona, ponieważ wynik dodatni tych testów nie musi informować o aktualnym zakażeniu, lecz może się utrzymywać nawet do dwóch lat po wyleczeniu nie nadają się do oceny skuteczności leczenia.

43. Oznaczanie modyfikacji lipoprotein:

44. ELISA (- wykrywanie antygenów, znaczniki, substraty): Jest to metoda heterogenna II generacji, stosowana w biochemii klinicznej do oznaczenia stężeń hormonów, markerów nowotworowych, immunoglobulin, w farmakologii klinicznej dla oceny stężeń leków we krwi, w serologii i w badaniach parazytologicznych, bakteriologicznych i wirusologicznych. ELISA pozwala na ilościowe oznaczenie wyniku, jest stosunkowo tania, nie naraża personelu na promieniowanie jonizujące, a odczynniki są dość stabilne. Wyróżnia się dwie grupy metod:

1. Metody wykrywania antygenu:

• Technika „sandwich”: Przeciwciała przeciw poszukiwanemu antygenowi są zaadsorbowane na powierzchni polistyrenowej. Po dodaniu próbki zawierającej antygen powstaje kompleks immunologiczny. Wykrywa się go za pomocą przeciwciała skierowanego przeciwko poszukiwanemu antygenowi, sprzężonego z enzymem.

• Technika immunologiczna pośrednia: Enzym jest sprzężony z surowicą antyglobulinową. Wykrywa ona wszystkie przeciwciała, bez względu na to, przeciwko jakiemu antygenowi są skierowane.

• Technika kompetycyjna: Zachodzi w dwóch etapach. Najpierw dochodzi do reakcji immunologicznej między zaadsorbowanymi przeciwciałami a antygenem poszukiwanym w próbce. W drugim etapie do pozostałych przeciwciał przyłącza się antygen kontrolny, znakowany enzymem. Im więcej poszukiwanego antygenu jest w próbce, tym mniej antygenu kontrolnego się przyłącza i tym mniejsze będzie nasilenie reakcji enzymatycznej.

• Technika zahamowania ELISA: Przeciwciała obecne w roztworze wiążą się z poszukiwanym antygenem. Następnie wolne przeciwciała reagują z antygenem kontrolnym, zaadsorbowanym na polistyrenie. Powstały kompleks jest wykrywany przez surowicę antyglobulinową sprzężoną z enzymem. Im więcej antygenu jest w badanej próbce, tym nasilenie reakcji enzymatycznej mniejsze.

1. Metody wykrywania przeciwciał:

• Technika znakowanego antygenu: antygen ulega związaniu z powierzchnią płytki, po dodaniu surowicy zawierającej poszukiwane przeciwciała tworzy się kompleks immunologiczny, który wykrywany jest przez antygen kontrolny sprzężony z enzymem.

• Technika immunoenzymatyczna pośrednia: antygen jest zaadsorbowany na polistyrenie, przeciwciała obecne w badanej próbce wiążą się z nim. Powstały kompleks wykrywany jest przez surowicę antyglobulinową sprzężoną z enzymem.

1. Znaczniki i substraty: Znaczniki odpowiadają enzymom, które są wykorzystywane do znakowania, substraty to związki konieczne do zajścia reakcji enzymatycznej.

ENZYM	ŹRÓDŁO	SUBSTRAT
peroksydaza	chrzan	o-fenylodiamina tetrametylenobenzydyna kwas 5-aminosalicylowy
AP	E. coli	p-nitrofenylofosforan
D-galaktozydaza	E-coli	nitrofenylo-D-galaktozyd

45. Porfiria ostra przerywana:

1. Mechanizm patobiochemiczny: Jest to najczęściej występujące zaburzenie syntezy porfiryn, dziedziczone autosomalnie dominująco. Polega na zmniejszeniu aktywności syntazy uroporfirynogenowej I, która przeprowadza PBG w dihydroksymetylenobeznen, który następnie samorzutnie cyklizuje do uroporfirynogenu I. W wyniku tego, dochodzi do zmniejszenia powstawania hemu, co znosi hamowanie syntazy ALA dochodzi do derepresji genu syntazy ALA i jej przyspieszonej syntezy, zwiększając stężenie hemu do prawidłowego, ale również podwyższając ilość ALA i PBG (związki przed blokiem!). Nagromadzenie tych intermediatów prowadzi do zaburzeń, ponieważ PBG hamuje uwalnianie acetylocholiny w płytkach nerwowo-mięśniowych, a ALA hamuje aktywność ATP-azy w tkance mózgowej.

2. Defekt: Zmniejszona aktywność syntazy uroporfirynogenowej I, która ujawnia się w sytuacjach zwiększonego zapotrzebowania na pierścień porfirynowy, np. po podaniu leków degradowanych przez system cytochromu P-450, w którego skład wchodzi hem barbiturany, środki antykoncepcyjne. Defekt może się ujawnić również np. w czasie zakażeń lub odchudzania, a także ciąży, pierwszej miesiączki, po wstrząsie psychicznym i zabiegu chirurgicznym.

3. Skutki - obraz kliniczny: Najczęstszym objawem są napadowe kolki brzuszne, o charakterze rozlanym, które należy różnicować z ostrym brzuchem. Różne są ich czasy trwania i okresy międzynapadowe, mogą im towarzyszyć wymioty i biegunka. Objawy ze strony układu nerwowego obejmują parestezje, silne bóle i porażenia nerwów czaszkowych lub rdzeniowych. Może nawet dojść do porażenia mięśni oddechowych, przełykowych, objawów hemiplegii i tetraplegii. Mocz oddany w czasie napadu na zabarwienie ciemnoczerwone (może się ono też pojawić dopiero po jakimś czasie). Zawartość ALA i PBG w moczu podwyższona.

4. Diagnostyka: Polega na oznaczaniu w pierwszej kolejności ALA i PBG w moczu zebranym w czasie ataku. Następnie przeprowadza się badanie stężenia ALA i PBG w DZM, porfiryn w kale z frakcjami w przypadku ich zwiększonej ilości oraz oznaczenie erytrocytarnej deaminazt PBG i porfiryn w osoczu.

46. Azot BUN: Jest to azot mocznika. Jego stężenie w surowicy powinno wynosić 7,1-16,3 mmol/l lub 10-23 mg%. Można go obliczyć mając znane stężenie mocznika, mnożąc je przez 0,46, która to wartość jest stosunkiem masy azotu w moczniku do masy mocznika.

47. Urobilina - pochodzenie i oznaczanie: Urobilina jest obecna w moczu w wyniku utleniania się urobilinogenu pod wpływem powietrza. Urobilinogen powstaje w wyniku rozprzęgania bilirubiny przez bakterie w przewodzie pokaramowym, następnie kilkakrotnej redukcji, reabsorpcji do krążenia wrotnego i przejścia przez wątrobę do krążenia ogólnego. Oznaczenie urobiliny przeprowadza się w moczu z odczynnikiem Ehrlicha czyli paradimetylobenzaldehydem. Jest to metoda półilościowa - możemy określić, czy urobilina jest wzmożona, silnie wzmożona, nieobecna lub obecna. W warunkach prawidłowych, urobilinogen jest obecny, wszystkie pozostałe sytuacje są patologiczne.

48. Historia testów ciążowych: Pierwsze testy ciążowe opierały się na biologicznych metodach oznaczania stężeń hormonów. Polegały one na wstrzykiwaniu niedojrzałym samicom różnych gatunków zwierząt laboratoryjnych odpowiednio przygotowanego moczu kobiety. Pod wpływem hCG obecnego w tym moczu, obserwowano u tych zwierząt owulację (np. u myszy w metodzie Ascheima-Zondeka), przyrost masy macicy lub zmniejszenie stężenia kwasu askorbinowego w jajniku samic szczurów. U samców natomiast dochodziło do przyrostu masy gruczołu krokowego u szczurów i uwalnianie u żab plemników do dróg moczowych. Obecnie stosuje się testy opierające się na immonochromatografii, wykrywające również podwyższony poziom hCG.

49. Wapń - przeliczanie stężeń, kalcemia: Prawidłowa kalcemia, czyli stężenie wapnia w surowicy, wynosi 2,25-2,75 mmol/l czyli 9-11 mg%. Wapń występuje w trzech frakcjach - jako wapń zjonizowany, stanowiący ok. 50% całości, związany ze związkami drobnocząsteczkowymi - cytrynianami, fosforanami, siarczanami - 10% oraz jako wapń związany z białkami, głównie albuminami, którego łącznie jest 40%. Kalcemia jest uwarunkowana współistnieniem trzech procesów - odkładaniem się lub mobilizacją wapnia z kości, wchłanianiem wapnia z przewodu pokarmowego, wydalaniem wapnia z moczem.

1. Hiperkalcemia.

2. Hipokalcemia: Jest to stan, w którym stężenie wapnia całkowitego w surowicy jest niższe niż 2,25 mmol/l. Do przyczyn hiperkalcemii zaliczamy:

• Zmniejszenie biosyntezy, wydzielania lub uszkodzenie efektora dla parathormonu.

• Niedoczynność przytrarczyc uwarunkowana brakiem PTH.

• Rzekoma niedoczynność przytarczyc.

• Hipokaliemia, hiperfosfatemia.

• Oporność na PTH spowodowana niedoborem magnezu i witaminy D.

• Zaburzenia przemian witaminy D.

• Mała podaż witaminy D w diecie.

• Obniżone wchłanianie w przewodzie pokarmowym.

• Niedostateczne naświetlanie skóry promieniami UV.

• Przyspieszony metabolizm przy podawaniu leków przeciwpadaczkowych.

• Zaburzony metabolizm w chorobach nerek i wątroby - zaburzona hydroksylacja.

• Oporność na witaminę D, która powstaje w marskości żółciowej wątroby i przewlekłej niewydolności nerek

• Pierwotne zaburzenia gospodarki wapniowej, magnezowej lub sekrecji kalcytoniny.

• Zaburzone wchłanianie wapnia z przewodu pokarmowego.

• Nadmierne odkładanie soli wapnia, np. w ostrym zapaleniu trzustki.

• Nadmierna utrata wapnia z moczem, np. w wyniku działania leków moczopędnych.

• Hipokalcemia wywołana niedoborem magnezu, co może spowodować wtórną niedoczynność przytarczyc.

• Hiperfosfatemia.

• Nadmierna podaż fosforanów.

• Choroby nerek.

• Uwalnianie fosforanów z rozpadających się nowotworów.

• Polekowa hipokalcemia, spowodowana wpływem cytrynianu, EDTA, bifosfonianów, kalcytoniny.

• Hipoproteinemia.

Hipokalcemię obserwuje się w: jatrogennej niedoczynności przytarczyc, żółtaczkach mechanicznych, niewydolności nerek, ostrym zapaleniu trzustki, niedoborze witaminy D, raku rdzeniastym tarczycy, zespołach złego wchłaniania, a także czasem w przypadku przyjmowania: furosemidu, chelatorów, kortykosterydów, gentamycyny, heparyny, insuliny, sulfonamidów, nadmiernych dawek środków przeczyszczających.

Przeliczanie stężeń: Jest ono konieczne przy interpretacji wyników oznaczeń stężenia wapnia w surowicy u osób z patologicznymi wartościami pH, ponieważ od pH zależy powinowactwo albuminy do Ca, a co za tym idzie, stężenie wapnia zjonizowanego w osoczu.

Ca skorygowane = Ca oznaczone + 0,05 x 7,4

Koryguje się również stężenie wapnia u pacjentów z patologicznym stężeniem albumin.

Ca skorygowane = Ca oznaczone + 0,02 x (40-stężenie albumin)

50. HDL: HDL - lipoproteiny o dużej gęstości to wysoce heterogenne cząstki, powstają w wątrobie, jelicie cienkim i w węzłach chłonnych, wykorzystując pozostałości fosfolipidów z rozpadających się komórek.

1. Cykl HDL:

• Białka HDL produkowane są w wątrobie, należą do nich najważniejsze apo A-I i apo A-II występujące u 2/3 cząstek. Pierwotnie powstaje tzw. natywny HDL, wędrujący z pre-β-Lp, składa się on właściwie tylko z fosfolipidów i apo A-I. Ma bardzo niewiele cholesterolu. Posiada konformację bardzo niekorzystną dla transportu cząsteczki, ponieważ przybiera ona kształt dyskoidalny, o dużej powierzchni. Łączy się on poprzez apo A-I z białkiem ABC-A1, należącym do rodziny ATP Binding Cassette, które przekazuje cholesterol z komórek tkanek obwodowych do HDLi Powstają cząstki HDL3.

• HDL3 posiadają więcej cholesterolu w stosunku do cząstek natywnych, wędrują we frakcji α i są bardziej kuliste. Jest to wynikiem działania LCAT - acylotransferazy lecytyna:cholesterol, aktywowanej przez apo A-I, która estryfikuje cholesterol jedną resztą kwasu tłuszczowego pochodzącą z fosfolipidu - lecytyny (powstaje lizolecytyna). Zestryfikowany cholesterol jest bardziej hydrofobowy niż forma wolna, dlatego przemieszcza się do środka cząstki, pod warstwę fosfolipidów, co prowadzi do zmiany kształtu HDL. HDL3 dalej krąży we krwi i dalej odbiera cholesterol od tkanek obwodowych, tym razem poprzez kontakt apo A-I z białkiem ABC-G1. Cząstka jest ponownie wzbogacona w cholesterol (ponownie działa też LCAT), dochodzi do dojrzewania HDL Powstają HDL2a, które otrzymują dodatkowo białka apo C-II i apo-E od VLDL.

• HDL2a łączy metabolizm HDL z VLDL i LDL. Przy udziale białka CETP - białko przenoszące estry cholesterolu, dochodzi do przeniesienia zestryfikowanego cholesterolu z HDL do cząstek o mniejszej gęstości (przekazywane są również białka apo C-II i apo E) . VLDL transportują cholesterol do wątroby, gdzie może być zużyty np. do syntezy kwasów żółciowych, LDL - do wątroby i innych tkanek. Jednocześnie HDL otrzymuje od VLDL triglicerydy (dojrzewanie VLDL). Powstają cząstki HDL2b.

• HDL2b zawierają stosunkowo dużo TG i mało cholesterolu. Dostaje się do wątroby, gdzie triglicerydy i fosfolipidy ulegają rozkładowi pod wpływem HTGL - lipazy wątrobowej. Powstają ponownie HDL3 Zamknięcie cyklu.

1. Metabolizm HDL: HDLe mogą być metabolizowane na dwa sposoby. U człowieka częstsza jest droga pośrednia, poprzez działanie CETP i HTGL, w wyniku czego cząstka HDL zostaje zredukowana do apo A-I, ulega filtracji kłębuszkowej i cewkach proksymalnych jest wyłapywana przez megalinę-cubilinę. Droga rzadsza - bezpośrednia, polega na wyłapaniu HDL przez receptor SR-B1, należący do rodziny receptorów Scavenger. Dochodzi do selektywnego wychwytu cholesterolu - tylko cholesterol ulega internalizacji, czyli, inaczej niż w przypadku LDL, nie jest wyłapywana cała lipoproteina.

2. Transport zwrotny cholesterolu: Cząstki HDL3 odbierają cholesterol niesestryfikowany z tkanek, estryfikują go przy udziale LCAT i powstają HDL2a. One przekazują estry cholesterolu przez CETP na VLDL, które w postaci remnantów VLDL transportują je do wątroby.

3. Diagnostyka: Oznaczanie stężenia frakcji HDL polega na selektywnym wytrącaniu VLDL i LDL. Odczynnikiem wytrącającym może być np. glikol polietylenowy. Dalej oznaczanie HDL przeprowadza się z wykorzystaniem reakcji enzymatycznych z udziałem esterazy i oksydazy cholesterolowej oraz metody Trindera z peroksydazą, fenolem i 4-aminoantypiryną.

51. Żółtaczki wrodzone: I.

I. Przebiegające ze zwiększeniem stężenia bilirubiny wolnej:

1. Zespół Criglera-Najjara typu I: jest to genetycznie uwarunkowane zaburzenie przemiany bilirubiny, wynikające z braku UDPG-transferazy w wątrobie. Dziedziczone autosomalnie recesywnie. Stężenie bilirubiny w surowicy wynosi ponad 340 μmol/l (20 mg%), pojawiają się objawy kernicterus. Żółć jest blada, zawiera śladowe ilości bilirubiny wolnej i monoglukuronidu bilirubiny. Zmniejszone jest wydalanie sterkobilinogenu z kałem, barwniki żółciowe są w moczu nieobecne. Objawy pojawiają się zwykle już w pierwszych dniach życia, większość chorych umiera w ciągu dwóch pierwszych lat.

2. Zespół Criglera-Najjara typu II: charakteryzuje się częściowym niedoborem UDPG-transferazy, dziedziczona genem autosomalnym, najprawdopodobniej recesywnie. Bilirubinemia jest zwykle niższa od 20 mg%, w żółci stwierdza się podwyższone ilości monoglukuronidu bilirubiny, w wątrobie obniżoną aktywność UDPG-transferazy. Encefalopatia bilirubinowa jest stwierdzana rzadziej niż w typie I.

3. Zespół Gilberta: zaburzenie dziedziczone autosomalnie dominująco, spowodowane jest zmniejszonym klirensem wątrobowym wolnej bilirubiny i zmniejszoną ekspresją UDPG-transferazy. Prowadzi do upośledzenia przemian bilirubiny o łagodnym charakterze. Hiperbilirubinemia u chorych zwykle nie przekracza 51 μmol/l (3 mg%), wydalanie sterkobilinogenu z kałem jest prawidłowe lub nieznacznie zmniejszone, wydalanie urobilinogenu z moczem - zmniejszone, a próby czynnościowe i enzymatyczne wątroby - prawidłowe. Czasem można zaobserwować zmiany w błonie komórkowej hepatocytów na biegunie naczyniowym i ewentualnie ziarnistości barwnika. W żółci przeważają monoglukuronid, aktywność UDPG-transferazy w hepatocytach jest obniżona. Hiperbilirubinemia nasila się w okresach głodzenia, stresu, miesiączkowania, infekcji lub wysiłku fizycznego. Do objawów można zaliczyć ogólne zmęczenie i osłabienie oraz zaburzenia trawienia.

II. Przebiegające ze zwiększeniem stężenia bilirubiny sprzężonej:

1. Zespół Dubina-Johnsona: jest to defekt przemian bilirubiny dziedziczony autosomalnie recesywnie, spowodowany upośledzonym wydalaniem bilirubiny sprzężonej na biegunie żółciowym hepatocytu i gromadzeniu się w komórkach wątroby i częściowo w komórkach USŚ złogów barwnika melaninopodobnego. Występuje hiperbilirubinemia z przewagą bilirubiny związanej, upośledzone jest wydalanie bilirubiny sprzężonej do żółci, pozostałe próby wątrobowe w porządku. W czasie badania laparoskopowego wątroba jest zielonoczarna lub ciemnoczarna, nie da się uwidocznić pęcherzyka żółciowego i dróg żółciowych przy pomocy kontrastu. 90% obecnej w moczu koproporfiryny to izomer typu I (w warunkach prawidłowych to ok. 35%), przy łącznej prawidłowej zawartości koproporfiryn.

2. Zespół Rotora: jest to genetycznie uwarunkowane zaburzenie przemiany bilirubiny, podobne do zespołu Dubina-Johnsona, różniące się jedynie nieobecnością złogów barwnikowych w hepatocytach, uwidocznieniem pęcherzyka w czasie badania cholescystograficznego i wzmożonym wydalanie koproporfiryn, z przewagą izomeru I, z moczem.

52. Pheochromocytoma: Guz chromochłonny, jest nowotworem wywodzącym się z rdzenia nadnerczy lub z tkanki chromochłonnej pozanadnerczowej, zwykle w jamie brzusznej. Charakterystyczne dla niego jest zwiększone stężenie MHM - kwasu wanilinomigdałowego, będącego metabolitem końcowym przemian adrenaliny i noradrenaliny. Guz chromochłonny wydziela prócz katecholamin ACTH, somatostatynę, kalcytoninę, enkefaliny, endorfiny, cholecystokininę, gastrynę, chromograninę i jeszcze inne substancje. Około 10% przypadków pheochromocytoma to nowotwory złośliwe, które dają przerzuty do węzłów chłonnych, wątroby, płuc i kości. Również u 10% pacjentów występuje on rodzinnie. Głównym objawem jest napadowe nadciśnienie, zblednięcie powłok skórnych, tachykardia związane z nadmiernym, nagłym uwalnianiem adrenaliny z guza.

53. Diagnostyka żółtaczki hemolitycznej diagnostyka różnicowa żółtaczek:

BADANIE	TYP ŻÓŁTACZKI
		HEMOLITYCZNA	MIĄŻSZOWA	CHOLESTATYCZNA
bilirubina całkowita:	↑	↑	↑
bilirubina pośrednia:	↑	↑	bz
bilirubina bezpośrednia:	bz	↑	↑
bilirubina w moczu:	brak	obecna	obecna
urobilinogen w moczu:	↑	↑	bz/↑
sterkobilinogen w kale:	↑	↑	brak
żelazo w surowicy:	↑	↑	↓
odczyn van den Bergha:	pośredni	dwufazowy	bezpośredni
protrombina:	bz	↓	↓
enzymy indykatorowe:	bz	↑	bz/↑
enzymy cholestazy:	bz	bz/↑	↑
oporność krwinkowa:	↓	bz	bz
haptoglobina:	↓	bz/↓	bz
albumina:	bz	↓	bz/↓
Lp(X):	brak	brak	obecna

54. Mocznik - metody:

1. Manometryczne:

• Metoda Kowarskiego: reakcję przeprowadza się w aparacie Kowarskiego, mocznik rozkładany jest alkalicznym podbrominem sodu dodawanym w nadmiarze. Jego zawartość w odbiałczonej próbce surowicy lub moczu oblicza się z ilości wydzielonego azotu po usunięciu dwutlenku węgla przez związanie go z wodorotlenkiem sodu.

1. Kolorymetryczne:

• Metoda Yatzidisa: mocznik tworzy barwny kompleks z odczynnikiem Ehrlicha po uprzedniej absorpcji związków interferujących na węglu aktywnym.

• Metoda Nesslera: mocznik rozkładany jest przez ureazę do dwutlenku węgla i amoniaku. Powstały amoniak oznacza się w reakcji z odczynnikiem Nesslera.

• Metoda ureazowa sprzęgnięta z reakcją Berthelota: ureaza rozkłada mocznik, wydzielony amoniak reaguje następnie z podchlorynem i fenolem tworząc w obecności nitroprusydku sodowego błękit indofenolowy, który w środowisku alkalicznym ma zabarwienie niebieskie. Istnieje możliwość błędu z powodu reakcji z amoniakiem z osocza i z powietrza.

• Reakcja mocznika z diacetylomonooksymem w obecności tiosemikarbazydu: dochodzi do powstania kompleksu o czerwonym zabarwieniu wykazującego maksimum absorpcji przy fali 525 nm. Metoda nie jest w pełni swoista, podobnie reaguje cytrulina i pochodne karbamidowe. Jej zaletą jest wyeliminowanie amoniaku.

• Z zastosowaniem antypiryny: w środowisku kwaśnym i podwyższonej temperaturze mocznik kondensuje z diacetylomonooksymem tworząc żółty związek. Wytwarza się również hydroksyloamina, która jest inhibitorem tej reakcji. Dodanie antypiryny łączącej się z hydroksyloaminą znosi to hamowanie.

1. Metoda enzymatyczna referencyjna:

• Test optyczny Warburga z reakcją wskaźnikową: wykorzystuje procesy katalizowane przez ureazę i dehydrogenazę glutaminianową. Reakcją wskaźnikową jest redukcja α-ketoglutaranu do glutaminianu, czemu towarzyszy utlenienie NAD zmniejsza się absorpcja światła przy długości fali 340 nm.

55. Białko Bence-Jonesa: Jest to białko termoprecypitacyjne - w czasie ogrzewania wytrąca się w temperaturze 56 stopni, przy dalszym podnoszeniu temperatury - ponownie się rozpuszcza. W czasie ochładzania również wytrąca się przy osiągnięciu 56 stopni, przy dalszym ochładzaniu znów ulega rozpuszczeniu. Odpowiada łańcuchom lekkim immunoglobolin lambda i kappa w elektroforezie. Jest ono wystarczająco małe by swobodnie ulegać filtracji. Oznaczanie jego obecności w moczu wiąże się z diagnostyką szpiczaka mnogiego - stwierdza się je u 2/3 chorych. Występuje również w makroglobulinemii Waldenstroema.

56. Metoda Drabkina: Metoda Drabkina opiera się utlenianiu hemoglobiny (i wszystkich jej pochodnych z wyjątkiem sulfhemoglobiny) pod wpływem żelazicyjanku potasu do methemoglobiny, która z cyjankiem potasu daje cyjanomethemoglobinę o barwie czerwonobrunatnej. Stężenie hemoglobiny oznacza się metodą kolorymetryczną, mierząc absorbancję przy długości fali 540 nm.

57. Składniki moczu:

58. LPL: Lipaza lipoproteinowa, jest to enzym należący do klasy hydrolaz i enzymów sekrecyjnych. Jest to również ektoenzym, związany ze śródbłonkiem poprzez stopkę z siarczanu heparanu aktywność LPL można oznaczyć dopiero we krwi heparynizowanej - podanie heparyny powoduje uwolnienie LPL z połączenia ze ścianą naczyniową. Lipaza lipoproteinowa rozkłada triglicerydy transportowane w lipoproteinach (w VLDL i chylomikronach) do glicerolu i wolnych kwasów tłuszczowych (z utworzeniem IDL i remnantów chylomikronów). Działa ona w naczyniach obwodowych - w tkankach pozawątrobowych, głównie w mięśniach, sercu i tkance tłuszczowej. LPL jest aktywowana przez apo C-II i insulinę, a hamowana przez apo C-III i siarczan protaminy. Z defektami LDL związana jest hiperlipoproteinemia typu I i typu V.

59. α1-inhibitor proteaz: Niskocząsteczkowe (51 kDa) białko ostrej fazy. Jest ono głównym inhibitorem elastazy leukocytarnej, obojętniej proteazy leukocytarnej, reniny, kalikreiny, urokinazy, plazminy i trombiny. Nie hamuje kolagenazy leukocytarnej. Łatwo penetruje do tkanek w stanach zapalnych i chroni je przed nadmierną aktywnością wymienionych enzymów proteolitycznych. W APR jego stężenie może wzrastać już po 24 h od wystąpienia objawów nawet do 4 razy, osiągając maksimum po 2-4 dniach. Normalizacja następuje po tygodniu.

Gen kodujący α1-IP znajduje się na 14 chromosomie i u człowieka został wykazany jego polimorfizm - w czasie elektroforezy można rozdzielić jego różne produkty. W patologii najważniejsze jest występowanie wariantu PiZ oraz wariantu PiNull - w obu tych przypadkach dochodzi do znaczącego obniżenia aktywności α1-IP odpowiednio do 15% i 0% normy. Elastaza leukocytarna nie jest wówczas hamowana, co prowadzi do uszkodzenia tkanek bogatych w elastynę, głównie płuc - występuje rozedma (genetycznie uwarunkowana rozedma płuc), a także wątroby.

60. Produkty peroksydacji i wolne rodniki:

1. Wolne rodniki: Do wolnych rodników zaliczamy rodnik ponadtlenkowy oraz rodnik hydroksylowy. Podobne właściwości, chociaż nie posiadają niesparowanych elektronów, wykazują inne reaktywne formy tlenu - RFT: tlen singletowy i nadtlenek wodoru.

• Rodnik ponadtlenkowy - powstaje w wyniku jednoelektronowej redukcji tlenu molekularnego.

• Rodnik hydroksylowy - jest produktem spontanicznej lub enzymatycznej reakcji, katalizowanej przez dysmutazę ponadtlenkową. Tworzy się on również w reakcji Fentona i Habera-Weissa.

• Tlen singletowy - powstaje m. in. w wyniku działania peroksydaz, a także reakcji między innymi RFT.

• Nadtlenek wodoru - tworzony w czasie dwuelektronowej redukcji tlenu cząsteczkowego.

RFT w warunkach fizjologicznych biorą udział m. in. w procesach redox w łańcuchu oddechowym, odtwarzania wiązań bogatoenergetycznych, odtruwania organizmu, syntezy prostaglandyn i leukotrienów a także podziału i rozwoju organizmu oraz metabolizmu ksenobiotyków i agregacji płytek.

W patogenezie, wolne rodniki mają znaczenie w karcinogenezie, w zespole reperfuzji i toksycznym uszkodzeniu spowodowanym związkami chemicznymi takimi jak CCl4, alkohol i dym papierosowy, poprzez swój wpływ na uszkodzenie struktury DNA i pękanie chromosomów, depolimeryzację kwasu hialuronowego, tworzenie nieprawidłowych wiązań krzyżowych w kolagenie i elastynie, uszkodzenie struktury i funkcji błon komórkowych oraz inaktywację enzymów.

1. Peroksydacja lipidów:

• Przebieg: proces peroksydacji składa się z 3 faz - inicjacji, polegającej na oderwaniu atomu wodoru id cząsteczki wielonienasyconego kwasu tłuszczowego lub takiej reszty wchodzącej w skład fosfolipidu; prolongacji będącej tworzeniem rodników nadtlenkowych i terminacji, czyli powstawania dimerów kwasów tłuszczowych lub zmodyfikowanych cząsteczek lipidów.

• Produkty peroksydacji - dimery kwasów tłuszczowych, keto- i hydroksykwasy tłuszczowe:

• Zmieniają właściwości antygenowe białek.

• Hamują aktywność enzymów, co prowadzi do hamowania transkrypcji i replikacji DNA.

• Powodują pęknięcia nici DNA.

• Są cytotoksyczne.

• Działają mutagennie i karcinogennie.

• Obniżają hydrofobowość lipidowego wnętrza błon komórkowych.

• Wpływają na depolaryzację błony.

• Zaburzają asymetrię lipidową błon.

• Hamują aktywność enzymów błonowych i białek transportowych.

• Powodują rozprzęganie fosforylacji oksydacyjnej w mitochondriach.

Peroksydacji mogą ulegać również inne związki - białka, aminokwasy i kwasy nukleinowe, jednak procesy te zachodzą z mniejszą wydajnością i mają mniejsze znaczenie dla organizmu.

61. Hiperfosfatemia: Jest to stan, w którym stężenie fosforanów nieorganicznych w surowicy przekracza 1,6 mmol/l. Może być ona spowodowana:

1. Wzmożonym wchłanianiem fosforanów z przewodu pokarmowego.

2. Wzrostem uwalniania fosforanów z rozpadających się tkanek.

3. Obniżeniem wydalania fosforanów przez nerki uwarunkowane niedoborem parathormonu, kortykosteroidów, a także niewydolność wydzielnicza nerek.

4. Podażą nadmiernej ilości witaminy D i 1,25-dihydroksycholekalcyferolu.

62. Gammapatie - podział i charakterystyka, diagnostyka step-by-step:

1. Gammapatia poliklonalna: Jest spowodowana odpowiedzią na pojawienie się antygenu, który może być czynnikiem zewnętrznym lub wewnętrznym, czyli dochodzi do indukcji produkcji przeciwciał. Produkowane przeciwciała należą do różnych klas, stąd w densytometrze mamy płaski, ale szeroki układ gammaglobulin. Przyczyny gammapatii poliklonalnej:

• Przewlekłe stany zapalne, infekcyjne i nieinfekcyjne, np. sarkoidoza, coliris ulcerosa.

• Choroby wątroby - marskość, przewlekłe agresywne zapalenie wątroby, będące zejściem ostrego zapalenia, w którym układ immunologiczny niszczy wątrobę.

• Kolagenozy - toczeń rumieniowaty układowy, reumatoidalne zapalenie stawów, ogniskowe zapalenie tętnic (SLE, RZS, PAN).

• Choroby autoimmunologiczne - zapalenie tarczycy, cukrzyca typu 1.

• Nowotwory.

1. Gammapatia monoklonalna: Jest spowodowana nadmierną produkcją przeciwciał przez dany klon komórek, zwykle w wyniku transformacji nowotworowej, co prowadzi do nagromadzenia identycznych immunoglobulin o takiej samej swoistości. W densytometrze wąski, wysoki pik. Przyczyny:

• Szpiczak mnogi - 51%

• Makroglobulinemia Waldenstroma - 15%

• Inne nowotwory złośliwe - 4%

• Białaczki i chłoniaki - 2%

• Marskość wątroby - 1,5%

• Samoistna bezobjawowa - MGUS jest to tzw. stan przedszpiczakowy, często stwierdzany u ludzi starszych.

• Choroba Franklina.

• Szpiczak poronny tylko z lekkimi łańcuchami.

1. Diagnostyka gammapatii:

1. Oznaczenie stężenia białka całkowitego - w 20% jest ono w normie.

2. Badanie elektroforetyczne białek z densytometrem.

3. Immunoelektroforeza.

4. Immunofiksacja (zamiast immunoelektroforezy).

5. Oznaczenie stężenia poszczególnych klas immunoglobulin - najczęściej stwierdza się wzrost stężenia IgG.

6. Metoda termoprecypitacyjna - oznaczanie białka Bence-Jones'a w moczu.

7. Wykrywanie łańcuchów lekkich metodą immunologiczną.

8. Rozmaz krwi obwodowej.

9. Punkcja szpiku z mostka lub talerza biodrowego.

10. Diagnostyka różnicowa dla wykluczenia innych przyczyn gammapatii. Głównie w przypadku gammapatii poliklonalnej dla wykluczenia chorób wątroby.

2. Diagnostyka różnicowa:

BADANIE	GAMMAPATIA MONOKLONALNA	GAMMAPATIA POLIKLONALNA
Elektroforeza	wąskie pasmo	szerokie pasmo
Mocz	BJP często obecne	BJP nieobecne
Łańcuch ciężki	jeden typ	kilka typów
Nieswoiste odczyny kiłowe	-	+
RF	-	+
ANA	-	+

63. DZM: Dobowa zbiórka moczu. Przeprowadza się ją w następujący sposób - należy wyłączyć ranną porcję moczu w momencie rozpoczęcia zbiórki, a włączyć ranną porcję następnego dnia - ostatnia porcja moczu. Istotne jest przechowywanie moczu podczas przeprowadzania zbiórki w lodówce i dobór naczynia o odpowiedniej pojemności z możliwością pomiaru objętości. Po zakończeniu zbiórki pacjent zapisuje objętość całkowitą DZM, miesza mocz i przynosi do laboratorium jego próbkę, nie całą objętość

64. Diagnostyka gospodarki żelazowej: W celu oceny gospodarki żelazowej oznacza się następujące parametry:

1. Stężenie żelaza w surowicy: Oznacza się je metodą kolorymetryczną z disulfonianem batofenantroliny. Stężenie żelaza w surowicy odzwierciedla tylko niewielką pulę żelaza organizmu i jest zależne od różnych czynników wykazuje rytm dobowy i miesięczny. Norma: 13-32 μmol/l lub 70-180 μg%

2. TIBC. Norma: 45-70 μmol/l lub 250-400 μg%

3. Stężenie transferyny: Oznacza się je metodami immunochemicznymi, ma wartość diagnostyczną w połączeniu z wynikami badań stężenia Fe w surowicy oraz TIBC. W niskim stężeniu Fe spowodowanym niepowikłanym niedoborem żelaza stężenie transferyny jest wysokie, a w niedokrwistościach o innym podłożu obserwuje się obniżenie stężenia zarówno żelaza jak i transferyny. W stanach zapalnych i w NPL stężenie transferyny spada, ponieważ jest to APP. Obniżone stężenie wiąże się również z przewlekłymi uszkodzeniami wątroby, niedożywieniem i zespołem nerczycowym. Stężenie podwyższone jest obserwowane w ciąży i podczas podawania estrogenów. Norma: 1,2-2,5 g/l czyli 120-250 mg%

4. Stężenie receptora transferyny: Oznacza się metodą ELISA. Jego stężenie wzrasta we wczesnym stadium niedoboru żelaza i w warunkach wzmożonej erytropoezy. W niedokrwistościach towarzyszących chorobom przewlekłym stężenie jest prawidłowe.

5. Stężenie ferrytyny: Jest ono markerem zapasów żelaza, pozwala na wykrycie zmniejszonej ilości zmagazynowanego żelaza zanim wystąpi niedokrwistość niedobarwliwa. Norma: 1,5-20 μg%

6. Test doustnego obciążenia żelazem: Krzywa żelazowa, pozwala ocenić wchłanianie żelaza z przewodu pokarmowego. Podaje się doustnie 1 g Fe2(SO4)3 i oznacza się stężenie żelaza w surowicy co godzinę przez 6 godzin. Maksimum jest osiągane po 3 godzinach. Prawidłowo przyrost żelaza nie przekracza 100% wartości wyjściowej. W niedoborach żelaza przy prawidłowym wchłanianiu Fe, przyrost jest gwałtowny. Krzywa płaska świadczy o upośledzeniu wchłaniania.

7. Test desferoksyaminowy: Pozwala na ocenę przeładowania organizmu żelazem. Związek ten tworzy kompleks z Fe, co powoduje zwiększenie jego wydalania z moczem.

65. Techniki przesiewowe wykrywania zmian nukleotydów: Techniki te wykorzystują produkty PCR i pozwalają na wykrycie i identyfikację mutacji. Są oparte na porównaniu wielkości i właściwości badanych fragmentów DNA. DNA ulega najpierw amplifikacji, a następnie jest rozdzielany na żelu poliakrylamidowym natywnym lub denaturującym. Metody te pozwalają na wykazanie, czy w danej cząsteczce DNA nastąpiła zmiana sekwencji nukleotydów. Zaliczamy do nich:

1. PCR-HD.

2. PCR-SSCP.

3. PCR-DGGE/TGGE: Jest to analiza elektroforetyczna w gradiencie czynnika denaturującego. Powielone w PCR fragmenty DNA nanosi się na żel poliakrylamidowy, na którym utworzony jest rosnący gradient czynnika denaturującego - mocznik, formaldehyd, temperatura. Fragment DNA, migrując w żelu, natrafia na takie stężenie czynnika, które powoduje dysocjację podwójnej helisy na pojedyncze nici. W rezultacie w obrazie elektroforetycznym otrzymuje się różne prążki świadczące o zaburzeniach struktury DNA. Metoda ta umożliwia wykrycie nieznanych mutacji.

66. Metoda wychwytywania hormonów tarczycy przez żywicę - wykonanie, interpretacja, zastosowanie:

1. Wykonanie: Test ten pozwala pośrednio określić możliwość wiązania hormonów tarczycy przez białka surowicy, głównie TBG. Opiera się on na wysyceniu miejsc wiążących hormony tarczycy na powierzchni białek wiążących te hormony, poprzez dodanie do próbki surowicy egzogennych hormonów tarczycy znakowanych izotopem jodu. Częściej wykonuje się test w stosunku do T3. Nadmiar znakowanego hormonu, który pozostał po całkowitym wysyceniu białek nośnikowych wiąże się z żywicą i mierzy jej radioaktywność. Stosowane są też erytrocyty lub sita molekularne.

2. Interpretacja:

• Zmniejszenie radioaktywności żywicy = zwiększenie stężenia hormonów tarczycy - ciąża, okres noworodkowy, defekty genetyczne TBG, przewlekłe stany zapalne, duże dawki estrogenów przyjmowanych doustnie (działanie anaboliczne) antykoncepcja i hormonalna terapia zastępcza, inne leki - klofibrat, 5-fluorouracyl, opiaty.

• Zwiększanie radioaktywności żywicy = zmniejszenie stężenia hormonów tarczycy - defekty genetyczne TBG, choroba i zespół Cushinga, ciężkie uszkodzenia wątroby, choroby wyniszczające, utrata białek związana z nefropatią - zespół nerczycowy lub enteropatią, GKS, androgeny.

1. Zastosowanie: Był dawniej stosowany do oceny pojemności białek wiążących hormony, co pozwalało określić ilość hormonów tarczycy w organizmie.

67. Markery osoczowe zawału mięśnia sercowego:

Nr	Rodzaj wskaźnika	Czas od początku objawów			Uwagi
				początek wzrostu		wartości szczytowe	normalizacja
1	cTnI cTnT (stężenie)	4-12 h	16-20 h	4-10 doba 4-14 doba	duża specyficzność, najwyższa czułość w 8-12 godzinie.
2	CK-MB (aktywność)	4-8 h	18-28 h	2-5 doba	dobra specyficzność i czułość, ograniczona możliwość rozpoznania po 36 h, możliwość rozpoznania dorzutu zawału, możliwość wczesnego rozpoznania martwicy
3	CK (aktywność)	4-8 h	16-24 h	2-5 doba	mała specyficzność, dobra czułość, możliwość wczesnego rozpoznania martwicy mięśnia sercowego
4	mioglobina (stężenie)	3-4 h	6-8 h	24 h	największa czułość w pierwszych godzinach rozwoju martwicy, mniejsza specyficzność
5	AspAT (aktywność)	6-12 h	24-48	5-7 doba	bardzo mała specyficzność, dość dobra czułość
6	HBDH (aktywność)	6-16 h	24-36	12-20 doba	mała specyficzność, stosowana w rozpoznaniu późnego okresu martwicy

68. Żółtaczka cholestatyczna:

1. Przyczyny: Żółtaczka cholestatyczna, czyli zastoinowa, wynika z obniżonego wydzielania żółci do dwunastnicy poprzez upośledzenie transportu w drogach żółciowych wewnątrzwątrobowych lub zewnątrzwątrobowych na skutek anatomicznego lub czynnościowego utrudnienia odpływu żółci lub pierwotnego uszkodzenia komórek wątroby. Przyczyny można podzielić na:

• Wewnątrzwątrobowe (patologia zlokalizowana poniżej prawego i lewego przewodu wątrobowego): zapalenie wątroby z nasiloną komponentą cholestatyczną, marskość żółciowa wątroby na tle immunologicznym (niszczenie, pogrubienie i naciek limfocytarny w kanalikach żółciowych), kamica dróg żółciowych, wrodzona niedrożność dróg żółciowych, zaburzenia ukrwienia wątroby we wstrząsie lub niewydolności wątroby.

• Zewnątrzwątrobowe: kamica dróg żółciowych, nowotwory dróg żółciowych, rak brodawki Vatera, rak głowy trzustki, ostre zapalenie trzustki, włóknienie przewodów żółciowych spowodowane chorobami autoimmunologicznymi.

Wzrost ciśnienia w drogach żółciowych prowadzi do odwrócenia biegunowości hepatocytu i wchłaniania bilirubiny sprzężonej do krwi.

1. Objawy: Żółtaczka, świąd skóry (podrażnienie zakończeń nerwowych), powiększenie wątroby, odbarwione stolce (żółć nie dostaje się do jelit, stąd brak sterkobilinogenu/sterkobiliny w kale, który przybiera wówczas kolor biało-żółty), ciemny mocz (bilirubina we krwi ma postać sprzężoną, która jest dobrze rozpuszczalna w wodzie, stąd będzie wydalana z moczem).

2. Żółtaczka cholestatyczna powikłana: w drogach żółciowych pojawiają się bakterie prowadząc do dekoniugacji i redukcji bilirubiny w drogach żółciowych powstaje urobilinogen, który pojawi się w moczu. Utrzymująca się kilka dni żółtaczka wraz ze wzmożonym ciśnieniem w drogach żółciowych prowadzi do marskości wzrost aktywności aminotransferaz i LDH 4 i 5 w osoczu - enzymy indykatorowe.

3. Badania.

69. Metody izolowania DNA z krwi pełnej: Obejmują one następujące etapy:

1. Liza komórek, które nie zawierają jąder - erytrocyty.

2. Odwirowanie leukocytów, uzyskanie osadu jąder.

3. Liza osadu jąder buforem do lizy.

4. Odbiałczenie przez ekstrakcję DNA fenolem lub chloroformem albo wytrącenie białka NaCl lub LiCl.

5. Wytrącenie DNA rozpuszczalnikiem organicznym - etanolem lub izopropanolem.

6. Przemycie osadu 70% etanolem i wysuszenie.

7. Rozpuszczenie w buforze.

70. Metody izolowania białek z materiału biologicznego:

1. Osmoliza: Jest to łagodna metoda wykorzystywana do rozbijania komórek, w czasie której komórki poddaje się działaniu roztworów hipoosmotycznych, a następnie łagodnie powoli zasysa się do pipety. Można również stosować enzymy - trypsynę, kolagenazę, lizozym, w stężeniach od 0.1 do 1%, które niszczą ścianę komórkową lub macierz zewnątrzkomórkową i następnie poddać działaniu roztworów hipoosmotycznych.

2. Homogenizacja: Polega na krojeniu tkanek na małe fragmenty. Proces ten wymaga stosowania chłodzenia w łaźni lodowej, co zapobiega przegrzewaniu się homogenatów.

3. Sonifikacja: Polega na wykorzystaniu ultradźwięków wytwarzanych przez generator elektryczny, które uszkadzają komórki. Wymagane jest również chłodzenie lodem tkanek i dalsze ich rozdrabnianie w homogenizatorach, które niszczą błony komórkowe.

71. B12: Jest to związek o budowie pierścieniowej - tetrapirol. Centralnie jest usytuowany atom kobaltu, który może tworzyć sześć wiązań koordynacyjnych z ligandami. W układach biologicznych β-ligand, czyli 6. pozycja atomu kobaltu jest połączony z grupami funkcyjnymi, co prowadzi do powstania pochodnych - hydroksykobalaminy (-OH), metylokobalaminy (-CH3), dezoksyadenozynokobalaminy (-Ado), cyjanokobalaminy (-CN). B12 występuje tylko w pokarmach pochodzenia zwierzęcego.

1. Funkcja: Składnik koenzymów karbamidowych, uczestniczących w reakcjach konwersji metylomalonylo-CoA do bursztynylo-CoA oraz metylacji homocysteiny do metioniny.

2. Przyczyny niedoboru:

• Niedostateczna podaż.

• Wrodzony brak IF, który jest niezbędny do wchłaniania tej witaminy.

• Resekcja żołądka.

• Upośledzone wydzielanie IF.

• Immunologicznie uwarunkowany niedobór IF - choroba Addisona-Biermera.

• Zaburzenia wchłaniania kompleksu IF-B12.

• Resekcja dystalnego odcinka jelita krętego.

• Upośledzone wiązanie witaminy B12 przez białka osocza, prowadzące do utraty B12 w nerkach defekt transkobalamin.

1. Skutki niedoboru:

• Układ krwiotwórczy:

• Niedokrwistość makrocytowa.

• Hipersegmentacja granulocyrów.

• Przewód pokarmowy:

• Zanik nabłonka wydzielniczego żołądka i jelit.

• Zapalenie języka.

• Układ nerwowy:

• Zaburzenia psychiczne.

• Zmiany zwyrodnieniowe sznurów tylnobocznych rdzenia kręgowego.

• Acyduria metylomalonowa.

• Hiperhomocysteinemia.

1. Diagnostyka:

• Test Schillinga.

• Oznaczanie stężenia kwasu metylomalonowego - jest on produktem szlaku pobocznego metabolizmu produktów β-oksydacji nieparzystowęglowych kwasów tłuszczowych, który ulega uaktywnieniu w przypadku niedoboru witaminy B12 i zahamowaniu działania mutazy metylomalonowej.

72. Glukozuria (cukromocz): W warunkach prawidłowych, glukoza jest całkowicie nieobecna w moczu (ewentualnie jej wydalone ilości są poniżej czułości pasków - 100 mg%). Ulega ona filtracji kłębuszkowej, jednak jest całkowicie resorbowana w cewkach proksymalnych. Jest to jednak substancja progowa, co oznacza, że jeżeli zostanie przekroczone pewne jej stężenie w osoczu, cała glukoza nie będzie w stanie ulec resorpcji zwrotnej i co za tym idzie, pewna jej ilość dostanie się do moczu ostatecznego. Jest ona wykrywana w moczu dzięki testom paskowym, opierającym się na reakcji enzymatycznej z oksydazą glukozową, w której glukoza utlenia się do kwasu glukonowego z wytworzeniem nadtlenku wodoru. To powoduje zmianę barwy paska testowego, co porównuje się ze skalą barw na opakowaniu. Można również dokonać odczytu przy użyciu analizatora moczu.

Próg nerkowy dla glukozy: 160-180 mg%

Rozróżnia się trzy typy cukromoczu:

1. Cukromocz łagodny:

• Typ A - spowodowany obniżeniem progu nerkowego i obniżeniem maksymalnej resorpcji glukozy.

• Typ B - obniżony prób nerkowy, resorpcja glukozy w normie.

• Typ C - Zupełny brak resorpcji glukozy.

2. Cukromocz w przebiegu cukrzycy i cukrzycy ciężarnych.

3. Cukromocz w przebiegu dysfunkcji kanalików nerkowych - zespół Fanconiego.

73. Jak uzyskać surowicę:

74. Stężenie żelu agarowego przy mniejszych i większych cząsteczkach: Do rozdziału mniejszych cząsteczek kwasów nukleinowych - 0,2-2,0 kbp, stosuje się żele 1,4-2%, a do rozdziału większych - 10-20 kbp, żele mniej stężone 0,5-0,7%

75. Czynniki denaturujące w żelu poliakrylamidowym: Najczęściej jest to mocznik (gradient stężenia 2-40%), formaldehyd (2-7 mol), chlorowodorek guanidyny oraz gradient temperatury. Związki te zapobiegają tworzeniu par przez zasady azotowe.

76. Polimorfizm a mutacja - porównać, znaczenie kliniczne:

1. Polimorfizm: oznacza występowanie różnic w DNA. Kryterium rozpoznawania polimorfizmu jest częstość występowania - zmiana musi pojawiać się częściej niż u 1% populacji. Do polimorfizmów zaliczamy SNP, czyli polimorfizm pojedynczego nukleotydu oraz polimorfizm sekwencji satelitarnych.

2. Mutacja: Jest to nagła, skokowa, bezwarunkowa, dziedzicząca się lub nie zmiana w materiale genetycznym organizmu, występująca rzadziej niż u 1% populacji.

3. Znaczenie kliniczne: Istnienie polimorfizmów genów kodujących rozmaite białka organizmu, a głównie enzymy, prowadzi do występowania różnych zespołów chorobowych. Do takich genów zaliczamy m. in. geny kodujące ACE, α1-IP, angiotensynogen. Polimorfizmy SNP mogą być wykrywane metodą RFLP.

77. Metoda refraktometryczna: Polega na mierzeniu współczynnika załamania światła za pomocą refraktometru - najczęściej stosowany jest refraktometr Abbego. Jest to metoda mało dokładna, ale pozwala w szybki i prosty sposób oznaczyć orientacyjnie poziom białka w surowicy. Stężenie białek, w zależności od współczynnika refrakcji, odczytuje się z tabeli.

Współczynnik refrakcji zależy w głównej mierze od stężenia białek, a w mniejszym stopniu od zawartości lipidów, cholesterolu i jonów nieorganicznych.

78. Metoda Lowry'ego i co wpływa na zafałszowanie wyników:

1. Zasada metody: Metoda ta umożliwia oznaczenie białka w zakresie stężeń 10-1000 μg/ml. Oparta jest na reakcji barwnej, która pochodzi z dwóch odczynników reakcji biuretowej z jonami miedzi w środowisku zasadowym i redukcji odczynnika fosfomolibdeno-fosfowolframowego (Folina-Ciocalteau) do błękitu molibdenowego przez obecne w białku tyrozynę i tryptofan. W zależności od zawartości tych aminokwasów w białku, różne białka dają różne natężenia barwy z odczynnikiem F-C stąd potrzeba stosowania odpowiednich wzorców białkowych.

2. Inne związki dające próbę: Z odczynnikiem fosfomolibdeno-fosfowolframowym reagują również i powodują zwiększenie natężenia barwy: fenole i ich pochodne i w mniejszym stopniu puryny, pirymidyny, kwas moczowy. Obniżenie intensywności zabarwienia powodują: siarczan cynku, siarczan amonowy (>0,1%), zobojętniony kwas trójchlorooctowy i nadchlorowy, aceton, mocznik (>1%), etanol i eter (>5%), a także zanieczyszczenia DNA. Zmętnienie prób jest wywoływane przez bufory fosforanowe w stężeniu powyżej 0,1 mola.

79. Gammaglobuliny i immunoglobuliny: Nie są to synonimy, ponieważ do frakcji gammaglobulin oprócz immunoglobulin zaliczamy również białko C-reaktywne, czynnik IX oraz kalikreinę.

80. α1-kwaśna glikoproteina: Inna nazwa - orozomukoid. Jest to małe białko (40 kDa), którego 45% masy cząsteczkowej stanowią cukrowce, w znacznej części kwas sialowy. W warunkach prawidłowych nie występuje ono poza wątrobą, ale w uogólnionym zakażeniu bakteryjnym - ARP, pojawia się również w neutrofilach i monocytach. Do funkcji orozomukoidu zalicza się:

1. Wiązanie progesteronu: bierze udział w dostarczaniu progesteronu do tkanek płodowych, a co za tym idzie, w różnicowaniu tkanek.

2. Udział w odpowiedzi immunologicznej zarówno swoistej jak i nieswoistej.

3. Hamuje fagocytozę w neutrofilach.

4. Hamowanie agregacji trombocytów.

5. Kofaktor LPL.

6. Wiązanie estradiolu, testosteronu i leków, przez co obniża ich skuteczność w stanach zapalnych.

81. Makroglobulinemia Waldenstroma: Jest to szpiczak produkujący immunoglobulinę M. Nazwa pochodzi od faktu, że IgM nawet w warunkach prawidłowych występuje w formie pentamerów, a w tej chorobie pentamery mają dodatkowo predyspozycję do asocjacji. Utworzony agregat ma tak dużą masę cząsteczkową, że w czasie elektroforezy praktycznie się nie porusza. Makroglobulinemia Waldenstroma odpowiada za 15% przypadku gammapatii monoklonalnych.

82. Metoda Quicka: Służy do oznaczania czasu protrombinowego. Jest to czas krzepnięcia osocza szczawianowego (krew pobiera się na szczawian potasu) w obecności nadmiaru jonów wapnia i nadmiaru tromboplastyny (TF). Jest to test pozwalający na ocenę aktywności osoczowych czynników krzepnięcia krwi II, V, VII i X ocena „drogi zewnątrzpochodnej”. Na podstawie wyniku tego testu można, prócz układu krzepnięcia, ocenić funkcje wątroby, ponieważ czynniki te, z wyjątkiem V, są produkowane przez wątrobę, a ponieważ czynnik VII jest białkiem o bardzo małym czasie półtrwania, patologiczny wynik PT otrzymamy bardzo szybko po uszkodzeniu wątroby ogromne znaczenie diagnostyczne. Podwyższony PT spotyka się również w niedoborze witaminy K o różnej etiologii. Test ten jest stosowany jako kontrola leczenia przeciwzakrzepowego oraz w przypadku leczenia innych zaburzeń krzepnięcia krwi.

Norma: 12-18 sekund, INR - 0,8-1,4, wskaźnik Quicka - 80-120%

83. Metoda Wolffa: Metoda opiera się na większej odporności karboksyhemoglobiny, czyli hemoglobiny połączonej z tlenkiem węgla CO, na strącanie w podwyższonej temperaturze - 56 stopni przy pH = 5 w porównaniu z innymi barwnikami krwi. Po koagulacji i odwirowaniu innych składników krwi, COHb pozostaje w roztworze i można ją oznaczyć np. metodą Drabkina.

3

---