CHARAKTERYSTYKA SKROBI WYIZOLOWANEJ Z ZIEMNIAKÓW I OCENA EFEKTYWNOŚCI HYDROLIZY KWASOWEJ I ENZYMATYCZNEJ KLEIKU SKROBIOWEGO

CHEMIA ŻYWNOŚCI

II ROK WNoŻiŻ

STUDIA NIESTACJONARNE

Autorzy opracowania:

dr D.Piasecka-Kwiatkowska

dr B. Stasińska

Skrobia jest roślinną substancją zapasową, odkładającą się szczególnie obficie w nasionach (ziarniaki zbóż, groch, fasola, bób) i bulwach (ziemniaki) w postaci ziaren skrobiowych o wielkości od 2 do 150 μm. Praktycznie wszystkie produkty mączne i kasze są źródłem skrobi. Stanowi ona ponad połowę węglowodanów spożywanych przez człowieka.

Pod względem chemicznym skrobia składa się z reszt α-D-glukopiranozy powiązanych ze sobą wiązaniami α-1,4-glikozydowymi. Tylko w punktach rozgałęzień występują wiązania α-1,6-glikozydowe. Jest cukrem nieredukującym, zbudowanym z dwóch różnych strukturalnie składników: amylozy i amylopektyny.

Amyloza stanowi na ogół 14-27% suchej masy skrobi, ma strukturę liniową, składa się z licznych (250-1000) reszt D-glukopiranozy, połączonych wiązaniami
α-1,4-glikozydowymi (ryc.1). Podstawową jednostką strukturalną jest maltoza, a pomiędzy jednostkami maltozowymi występuje także wiązanie α-1,4-glikozydowe. Cząsteczka amylozy nie jest rozgałęziona, lecz tworzy łańcuch skręcony śrubowo, przy czym na jeden skręt spirali przypada 6 reszt glukozy. Strukturę przestrzenną amylozy stabilizują wiązania wodorowe formujące się między wolnymi grupami OH. Kształt cząsteczki amylozy ma wpływ na jej reaktywność zarówno chemiczną, jak i biochemiczną. Amyloza daje z jodem intensywne niebieskie zabarwienie. Istota tego zjawiska polega na zagęszczaniu cząsteczek jodu w wolnych przestrzeniach ograniczonych przez cząsteczki glukozy. Taki związek wykazuje zmienione właściwości fizyczne (silną absorpcję światła).

Ryc.1. Fragment wzoru amylozy

Amylopektyna jest rozgałęzioną formą skrobi. Do łańcucha głównego zbudowanego z reszt glukozowych powiązanych wiązaniem α-1,4-glikozydowym są przyłączone wiązaniem α-1,6-glikozydowym łańcuchy boczne, które mogą się również rozgałęziać. W cząsteczce amylopektyny na jedno wiązanie α-1,6-glikozydowe przypada około trzydzieści wiązań α-1,4-glikozydowych. Ze względu na liczne rozgałęzienia amylopektyna przedstawia sferyczny, nieuporządkowany kłębek, w którym jedynie zewnętrzne łańcuchy mogą wykazywać strukturę spiralną. Dlatego amylopektyna daje z jodem zabarwienie fioletowe.

Ryc.2. Fragment wzoru amylopektyny

Obydwa składniki skrobi tworzą strukturę nadcząsteczkową, w której występują drobne krystaliczne micele oraz struktury amorficzne powiązane mostkami wodorowymi. Właściwości skrobi stanowią wypadkową właściwości obu jej składników i ich wzajemnego stosunku ilościowego. Oprócz rdzenia węglowodanowego skrobia zawiera niewielkie ilości białka
(do 0,5%), lipidów (ok.0,9%) oraz fosforu (0,05-0,25%) i wiele innych składników mineralnych. Zakłada się ponadto, że strukturalnym składnikiem skrobi jest woda. Jest ona związana za pomocą wiązań wodorowych z grupami OH reszt glukozy.

Skrobia jest nierozpuszczalna w wodzie oraz w większości rozpuszczalników organicznych. W zimnej wodzie ziarna skrobiowe pęcznieją i w określonej dla każdego rodzaju skrobi temperaturze kleikują, tzn. tracą strukturę ziarnistą. Zachodzi wtedy nieodwracalna dezintegracja makrocząsteczek i powstaje lepki kleik. Skrobia skleikowana ulega retrogradacji. Zjawisko to polega na wytworzeniu pomiędzy sąsiednimi cząsteczkami amylozy mostków wodorowych i powstaniu struktury krystalicznej. Skrobia taka jest odporna na działanie enzymów i dlatego retrogradacja może być w pewnych przypadkach zjawiskiem niekorzystnym. Retrogradacja skrobi jest również przyczyną czerstwienia pieczywa oraz zmian struktury skrobiowych artykułów żywnościowych. Zjawisku temu sprzyja duża zawartość amylozy w skrobi oraz obniżona do ok.0^oC temperatura.

Ogrzewanie skrobi do temperatury 180-200^oC prowadzi do depolimeryzacji (dekstrynizacji) cząsteczki skrobiowej oraz do wytworzenia się w dekstrynach rozgałęzień (np. powstają wiązania β-1,6-glikozydowe). Powstaje wówczas furfural i wiele substancji lotnych, m.in. kwas octowy i mrówkowy, aldehyd octowy i inne.

W zależności od tego, czy skrobia znajduje się w postaci natywnej, tzn. w postaci ziaren, czy też w formie rozpuszczonej (kleik skrobiowy), a więc częściowo fizycznie zdezintegrowanej, różne są jej właściwości chemiczne. Skrobia natywna jest mniej reaktywna, np. nie działają na nią (lub działają bardzo słabo) enzymy amylolityczne powodujące hydrolizę skrobi.

Hydroliza skrobi

Hydroliza kwasowa

Skrobia pod wpływem kwasów ulega stopniowej hydrolizie przez stadium dekstryn do maltozy i małej ilości glukozy. Pośrednimi produktami są: amylodekstryny, erytrodekstryny, achro- i maltodekstryny oraz maltoza. W miarę hydrolizy wzrastają stopniowo właściwości redukujące.

Ryc. 3. Schemat hydrolizy kwasowej skrobi

Hydroliza enzymatyczna

Hydroliza enzymatyczna skrobi przebiega przy udziale enzymów amylolitycznych. Jest procesem, który znalazł szerokie zastosowanie w różnych gałęziach przemysłu spożywczego, np. piekarskim, gorzelniczym, browarniczym. Amylazy należą do klasy hydrolaz, a więc enzymów rozkładających wiązania glikozydowe przy równoczesnym włączeniu cząsteczki wody. Enzymy amylolityczne występują w przyrodzie dość często, zarówno u roślin i zwierząt, jak i w komórkach drobnoustrojów. Do najważniejszych enzymów należą: α- i β-amylaza oraz α-glukozydaza.

α-amylaza, tzw. amylaza dekstrynująca, jest endoglikozydazą. Hydrolizuje wewnętrzne wiązania α-1,4-glikozydowe, dając maltozę, maltotriozę (maltodekstrynę) i α-dekstrynę (achrodekstrynę). W początkowej fazie hydrolizy α-amylaza powoduje szybki rozkład wiązań α-1,4-glikozydowych długiego łańcucha amylozy do drobnocząsteczkowych dekstryn (zawierających 6-7 reszt glukozy), które stopniowo podlegają dalszej degradacji do tri- i disachrydów (maltoza) oraz w nieznacznym stopniu do glukozy. Enzym ten atakuje wiązania glikozydowe, amylozy znajdujące się w środku łańcucha, rozkładając go na coraz mniejsze fragmenty. W wyniku działania α-amylazy na amylopektynę powstają różne rozgałęzione łańcuchy, zawierające kilka reszt glukozy. Na skutek działania α-amylazy spada lepkość kleiku skrobiowego.

Ryc.4. Schemat działania α-amylaz.

β-amylaza, tzw. amylaza cukrująca, jest egzoglikozydazą. Hydrolizuje skrobię do maltozy poprzez kolejne odłączanie dwóch reszt glukozy od nieredukujących końców łańcucha glikozydowego, tworząc maltozę. Enzym ten nie rozkłada wiązań
α-1,6-glikozydowych, dlatego amylozę rozkłada całkowicie (ryc.5a), a amylopektynę tylko w ok. 65%, pozostawiając „rdzeń” amylopektynowy, tzw. dekstrynę graniczną, zawierającą wszystkie rozgałęzienia (ryc.5b). Enzym ten rozkłada więc tylko boczne łańcuchy amylopektyny do maltozy, pozostawiając środkową część cząsteczki w postaci dużej dekstryny granicznej. Dalsza hydroliza tej dekstryny jest możliwa tylko dzięki łącznemu działaniu obu amylaz: α-amylaza rozcinając od środka nierozłożoną część amylopektyny na rozgałęzione fragmenty, powoduje jednocześnie uwolnienie się nowych odcinków łańcuchów prostych, które mogą być wówczas rozłożone przez β-amylazę do maltozy. Dwucukier maltoza jest następnie rozszczepiany przez α-glukozydazę do glukozy. Na skutek działania
β-amylazy wzrasta redukcyjność kleiku skrobiowego.

Ryc.5. Schemat działania β-amylaz: a) na amylozę b) na amylopektynę

Reakcje skrobi z jodem

Obecność skrobi w próbie można stwierdzić na podstawie próby jodowej. W obecności skrobi występuje charakterystyczne granatowe zabarwienie. Amyloza daje z jodem zabarwienie niebieskie, zaś amylopektyna fioletowe. Amyloza o konfiguracji liniowej nie jest zdolna do tworzenia kompleksu z jodem. Musi istnieć konfiguracja heliksu, aby cząsteczki jodu mogły się w niej regularnie ułożyć. Jedna cząsteczka jodu przypada na sześć reszt glukozylowych, czyli na jeden skręt heliksu. Ogrzewanie kleiku skrobiowego powoduje rozkręcanie się heliksu, co jest przyczyną zanikania niebieskiego zabarwienia z jodem.

Obserwując zmiany zabarwienia w trakcie wykonywania próby jodowej, można określić stopień zhydrolizowania skrobi. W obecności amylodekstryn zabarwienie przechodzi w fioletowe, erytrodekstryn w czerwone, achrodekstryn w pomarańczowe, natomiast maltodekstryny, maltoza oraz glukoza nie dają z jodem barwy.

Na tworzenie barwnych kompleksów z jodem istotny wpływ ma pH środowiska. Skrobia nie tworzy z jodem zabarwienia w środowisku zasadowym, gdyż jod przereaguje z zasadą według równania:

I₂ + 2NaOH NaIO + H₂O + NaI

W środowisku kwasowym reakcja przebiega w kierunku odwrotnym:

NaIO + NaI + 2HCl 2NaCl + I₂ + H₂O

Cel ćwiczenia

1. Izolacja skrobi z ziemniaków.

2. Badanie właściwości skrobi.

3. Porównanie efektywności hydrolizy kwasowej i enzymatycznej kleiku skrobiowego.

wykonanie ćwiczenia

1. Izolacja skrobi z ziemniaków

Obrane i umyte ziemniaki (ok. 3 sztuki) utrzeć na miazgę i dodać równą objętość wody, zmieszać i przesączyć przez kilka warstw gazy. Przesącz rozcieńczyć 2-3 krotnie wodą i zdekantować. Zlać ciecz znad osadu, skrobię zawiesić w etanolu i powtórnie zdekantować. Następnie skrobię wysuszyć na powietrzu.

2. Badanie rozpuszczalności skrobi

Do około 1g skrobi dodać kilka cm³ wody, dobrze wymieszać i przesączyć przez bibułę. Do przesączu wprowadzić kroplę roztworu I w KI. Zinterpretować.

3. Przygotowanie kleiku skrobiowego

W zlewce zagotować około 75 cm³ wody. W drugiej zlewce sporządzić jednolitą zawiesinę 1g skrobi w 15 cm³ zimnej wody, którą wlać do wrzącej wody ciągle mieszając. Zlewkę po zawiesinie przepłukać 10 cm³ wody i dodać do wrzącego roztworu. Gotować do całkowitego rozpuszczenia. Otrzymany opalizujący roztwór skrobi będzie wykorzystywany do dalszych doświadczeń.

4. Wysalanie skrobi

Do 3 cm³ kleiku skrobiowego dodać 5 cm³ nasyconego roztworu (NH₄)₂SO₄. Po 5 min przesączyć i do przesączu dodać kroplę I w KI. Brak zabarwienia świadczy o całkowitym wytrąceniu skrobi z roztworu. Zinterpretować.

5. Wpływ warunków środowiska na przebieg reakcji skrobi z jodem

• Temperatura

Do 2 cm³ kleiku skrobiowego dodać kroplę roztworu I w KI. Powstaje niebieskie zabarwienie. Probówkę ogrzać. Niebieskie zabarwienie znika. Po ochłodzeniu pod bieżącą wodą zabarwienie powraca. Zinterpretować.

• pH środowiska reakcji

Do 2 cm³ kleiku skrobiowego dodać kilka kropli 1 M roztworu NaOH i kroplę roztworu I w KI. Zabarwienie nie powstaje. Po zakwaszeniu kwasem solnym barwa pojawia się. Zinterpretować.

6. Hydroliza kleiku skrobiowego

• kwasowa

Do 12 cm³ roztworu kleiku skrobiowego dodać 3 cm³ stęż. H₂SO₄. Po zmieszaniu pobrać próbkę do badania efektywności hydrolizy, a następnie ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej. Co 3 minuty pobierać do analizy hydrolizat (patrz badanie efektywności hydrolizy).

• enzymatyczna

Do 13 cm³ roztworu kleiku skrobiowego dodać 2 cm³ roztworu enzymu. Bezpośrednio po zmieszaniu pobrać próbkę do badania efektywności hydrolizy, a następnie inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37^oC. Co 3 minuty pobierać do analizy hydrolizat (patrz badanie efektywności hydrolizy).

7. Badanie efektywności hydrolizy kwasowej i enzymatycznej kleiku skrobiowego

W dwóch statywach umieścić 2 szeregi probówek, w każdym po 5 sztuk. Jeden zestaw posłuży do określenia stopnia rozkładu skrobi w trakcie hydrolizy kwasowej, a drugi enzymatycznej. Bezpośrednio po rozpoczęciu hydrolizy, a następnie co 3 minuty przenosić, po 1 cm³ odpowiedniego hydrolizatu do probówek pierwszego i drugiego szeregu, znajdujących się w odpowiednim statywie. Do pierwszego szeregu dodać po 1 cm³ 0,002% roztworu I w KI i obserwować stopniowy zanik barwy. W drugim szeregu probówek hydrolizat doprowadzić roztworem NaOH do pH ok.8, dodać 3 cm³ odczynnika Benedicta i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 min. Obserwować powstający pomarańczowy osad Cu₂O.

Wyniki zestawić w tabeli i zinterpretować.

5

b)

a)

dekstryna graniczna

4

1

CH₂OH

OH

OH

O

O

4

1

CH₂OH

OH

OH

O

O

6

5

3

2

4

1

CH₂OH

OH

OH

O

O

4

1

CH₂OH

OH

OH

O

O

4

1

CH₂

OH

OH

O

O

---