2

Przygotowanie krzywej kalibracyjnej

Celem przygotowania krzywej kalibracyjnej dla każdej metody analizy ilościowej jest:

a/ wyznaczenie zależności między ilością analizowanej substancji, a wartością uzyskanych w doświadczeniu danych np. absorbancji. Wartości te możemy wykorzystać do sporządzenia wykresu, oraz do obliczenia współczynnika kalibracji,

b/ określenie zakresu metody, czyli wyznaczenie najmniejszej i największej ilości lub stężenia substancji jaką możemy zmierzyć stosując daną metodę analityczną,

c/ zbadanie czy stosowana metoda spełnia kryteria wynikające ze zjawisk, które stanowią podstawę używanej do analizy metody np.: w metodach kolorymetrycznych wypełniają kryterium liniowej zależności między stężeniem analizowanej substancji, a absorbancją uzyskanych roztworów barwnych.

Wykonanie:

Z roztworu macierzystego o stężeniu 0,lmg/ml glukozy przygotuj następujące roztwory:

1/ 10 p.g glukozy/0,6ml; 2/ 20 p.g glukozy/0,6ml; 3/ 30 p.g glukozy/0,6ml

W probówce szklanej zmieszaj kolejno:

0,6 ml standardu o określonym stężeniu glukozy 0,6 ml 100 mM buforu Tris/Cl'

0,1 ml lOOmM MgCl₂ 0,05 ml lOmM ATP

0,05 ml mieszaniny heksokinazy i dehydrogenazy. (Przygotowany rozwór enzymów jest 50 x rozcieńczony)

Składniki dokładnie wymieszaj przenieś do kuwety Dodaj 0,1 ml NADP⁺ i kuwetę wstaw do spektrofotometru.

Co 1 min notuj zmiany absorbancji przy X= 340 nm aż do stałej wartości odczytu.

Próbę „0” przygotuj jak wyżej dodając w miejsce roztworu glukozy 0,6 ml H₂0.

Na podstawie uzyskanych wyników wykreśl zależność wartości absorbancji od stężenia glukozy i oblicz współczynnik kalibracji „WK”.

Przygotowanie Materiału.

a. Surowica

Do probówki Eppendorfa z 0,5ml surowicy dodać 0,5ml H₂0 i lml HCI04. Dokładnie wymieszać i wirować 2min w mikro wirówce. Pobrać lml supematantu do probówki Eppendorfa i dodać lml 2,5M KOH. Ponownie dokładnie wymieszać i odwirować. Do oznaczeń supematant rozcieńczyć 5 krotnie H20.

b. Wątroba

5g wątroby rozdrobnić nożem i zhomogenizować w probówce plastikowej z dziesięcioma mililitrami H20 używając homogenizatora nożykowego. 4ml homogenatu przenieść do 2 probówek Eppendorfa i wirować 10 min przy 15tys. obr/min. Supematant rozcieńczyć 5x wodą destylowaną. W kolejnej probówce Eppendorfa zmieszać lml rozcieńczonego 5x supematantu z lml 5M HCI04 i wirować przez 2min w mikrowirówce. Ponownie pobrać lml supematantu i przenieść do suchej probówki, dodać lml 2,5M KOH, dokładnie wymieszać i