Agrobiotechnologia 7

Ćwiczenie 2

Przygotowanie reakcji POR ze starterem specyficznym

Składniki jednej reakcji (jedna próbkal:

-    12,3 pi H2O

-    2,0 pi 10 x bufor do PCR

-    2,0 pi MgCk [25 mM]

-    0,5 pi dNTP [10 mM]

-    0,5 pl start er-forward [10 pM] - ql8SRNA-fl

-    0,5 pl starter-reyerse [10 pM] - ql8SRNA-rl

-    0,2 pl enzym Taq polimeraza [5U/ pl]

-    2 pl DNA rozcieńczone

2 = 20 pl Wykonanie:

-    Wszystkie składniki reakcji należy po wyjęciu z zamrażarki i rozmrożeniu zworteksować i żwirować;

-    dodawać kolejno w podanych objętościach do probówek do PCR;

WAŻNE!!! Polimerazę Taq trzymamy cały czas lodzie

-    po umieszczeniu wszystkich składników reakcji w probówce, mieszaninę reakcyjną należy zworteksować i żwirować;

-    umieścić probówkę z mieszaniną reakcyjną w aparacie do amplifikacji DNA (termocykler); Program reakcji PCR:

1.    94°C — 5 min,

2.    92°C - 45 sek.; 57°C - 45 sek, 72°C - 2 min. [35 cykli]

3.    72°C - 10 min.

4.    4°C-co

Po zakończonej reakcji amplifikacji próbki można od razu poddać elektroforezie w żelu agarozowym lub przechować w zamrażarce (-18°C ) po czym rozdzielać elektroforetyczńie.