101954

•    Następny etap to dwukrotne przeprowadzenie reakcji nested-PCR (pierwsza ze starterami zewnętrznymi, druga -z wewnętrznymi). Dwukrotna reakcja ma na celu eliminację niepożądanych sekwencji (jeden z końców występuje powszechnie w wielu różnych mRNA, a celem eksperymentu jest amplifikacja tylko jednego).

•    Tak otrzymany produkt możemy poddać sekwencjonowaniu.

Nested PCR

•    Stosowany w celu zwiększenia specyficzności amplifikacji DNA.

•    Dwa zestawy starterów używane w 2 kolejnych reakcjach

•    W pierwszej reakcji PCR. jedna para zewnętrznych starterów jest używany do tworzenia produktów, które mogą zawierać sekwencje wzmacniane w innych obszarach

•    Produkty z 1 reakcji PCR są następnie wykorzystywane jako szablon w drugim PCR, z parą wewnętrznych starterów, zwiększając specyfikę reakcji. Nested PCR bardziej skuteczne, szczególnie we wzmacnianiu produktów DNA dłuższych niż konwencjonalne

•    Wymaga szczegółowej wiedzy na temat sekwencji docelowej

Rodzaje starterów stosowanych w PCR

Typy starterów:

Przedni (forward) - jego sekwencja musi być taka sama jak sekwencja powielana, wsteczny(reverse) - jego sekwencja

musi być komplementarna do powielanej.

Przyłączane do końca 3'

Primery uniwersalne sprzedawane jako składnik reakcji stosowanych do klonowania

•    Na matrycy mRNA syntetyzuje się cDNA przez wydłużenie startera przyłączonego blisko 5’ końca (czapeczki)

•    3' wydłuża się następnie przy pomocy TT w obecności dATP. Ogonek poliA jest miejscem zakotwiczenia startera. Jego wydłużenie tworzy dsDNA. Ta może być powielona standardową metodą PCR (Taq polimeraza)

Poszukiwanie eksonów - pułapka na eksony

•    Metoda wykorzystuje wektor zawierający sztuczny minigen złożony z 2 eksonów otaczających intron. Pierwszy ekson poprzedzony promotorem

•    Nowy DNA, zawierający niemapowane eksony poddaje się ligacji z wektorem i tak zrekombinowaną cząsteczkę wprowadza się do komórki gospodarza

•    Uzyskany transkrypt RN A badany jest metodą RT-PCR celem wskazania granic badanego egzonu.

Obecność miejsca restrykcyjnego stwarza możliwość wstawienia wektora.

Ustalenie funkcji genu - metody komputerowe.

•    Analizy baz danych, odpowiednie programy

•    Poszukiwanie homologii wobec genów już opisanych o zdefiniowanej funkcji. Geny homologiczne wywodzą się od wspólnego przodka ( nie muszą mieć identycznej sekwencji NT). Wśród nich:

o Ortologi - homologi obecne u różnych organizmów, które przed rozdzieleniem się gatunków miały wspólnego przodka. Geny takie zwykle mają takie same funkcje. Np. gen mioglobiny ludzkiej i szympansa.

O Paralogi - obecne w tym samym organizmie (członkowie rodzin wielogenowych), np. gen mioglobiny i beta-globiny człowieka.

o Homologia nie równa się podobieństwu (geny są lub nie są spokrewnione)

Analizy sekwencji aminokwasowych

•    Przedmiotem analiz są raczej sekwencje AA (a nie DNA, te mogą być przepisane na AA). Niespokrewnione geny bardziej różnią się przy porównywaniu sekwencji aminokwasowych. Wynik analiz porównawczych jest obdarzony mniejszym błędem (białka złożone z 2 AA, a DNA tylko z 4 nr)

•    Program porównuje (alignment) badaną sekwencję do tych zawartych w DB. Wartość wyliczonego współczynnika decyduje o homologii badanych sekwencji (ocena stopnia identyczności 2 sekwencji - liczba pozycji, w których w obu sekwencjach obecny jest dany AA). Liczba zamieniana na %.

•    BLAST - popularny program min. do identyfikacji spokrewnionych sekwencji. Identyczność sekwencji - 76%: na poziomie AA - 26%.

Funkcje genu - metody eksperymentalne

•    Duża grupa metod prowadzących do ustalenia funkcji genu oparta jest na specyficznej inaktywacji opartej na rekombinacji homologicznej. Najprostsze sposoby to ptzerwanie ciągłości genu niespokrewnionym fragmentem

2