Agrobiotechnologia 8

Ćwiczenie 2

Przygotowanie reakcji typu RAPD

Składniki jednej reakcji (jedna próbka):

-ll,7plH₂0

-    2,0 pl 10 x bufor do PCR

-    1,6 pl MgCl₂ [25 mM]

-    0,5 pl dNTP [10 mM]

-    2,0 pl starter [10 pM] - R-07

-    0,2 pl enzym Taq polimeraza [5U/ pl]

-    2 pl DNA rozcieńczone Z = 20 pl

Wykonanie:

-    Wszystkie składniki reakcji należy po wyjęciu z zamrażarki i rozmrożeniu zworteksować i żwirować;

-    dodawać kolejno w podanych objętościach do probówek do PCR;

WAŻNE!!! Polimerazę Taq trzymamy cały czas w lodzie

-    po umieszczeniu wszystkich składników reakcji w probówce, mieszaninę reakcyjną należy zworteksować i żwirować;

-    umieścić probówkę z mieszaniną reakcyjną w aparacie do amplifikacji DNA (termocykler); Program reakcji RAPD (RAPD42):

1.    94°C - 3 min,

2.    93°C - 30 sek.; 42°C - 1 min, 68°C - 2,5 min. [40 cykli]

3.    72°C - 5 min.

4.    4°C - oo

Po zakończonej reakcji amplifikacji próbki można od razu poddać elektroforezie w żelu agarozowym lub przechować w zamrażarce (-18°C ) po czym rozdzielać elektroforetycznie.