BA RE CW01 ds1 cw0p0175 4
staje użyty do hybrydyzacji, jako sondę najczęściej stosuje się znakowany fragment DNA, obejmujący gen rrs, obszar polimorficzny i gen rrl. Po płukaniu, które usuwa niezwiązane cząsteczki sondy filtr jest umieszczany w roztworze przeciwciał rozpoznających sondę, które są kowalencyjnie połączone z alkaliczną fosfatazą. Po odpłukaniu nadmiaru przeciwciał podaje się syntetyczny substrat dla alkalicznej fosfatazy. Aktywność tego enzymu w postaci che-miluminescencji jest wykrywana na kliszach fotograficznych. Widoczne są tam te prążki chromosomalnego DNA, które zawierały gen rrs lub rrl. Wyniki analizowane są manualnie lub za pomocą programu komputerowego.
Rybotypowanie metodą hybrydyzacyjną może być wykonane automatycznie, skonstruowano system RiboPrinter firmy Dupont Qualicon, który wykonuje wszystkie etapy rybo-typowania. Analizuje jednocześnie 8 próbek. Urządzenie przeprowadza liżę komórek z wykorzystaniem enzymów (lizostafiny i muraminidazy), co umożliwia izolowanie DNA z komórek różnych bakterii. Kolejne etapy procesu przebiegają analogicznie do opisanej wcześniej procedury manualnej. Wynik jest uzyskiwany w specjalnym czytniku, bez użycia kliszy fotograficznej. Cały proces trwa 8 godzin. RiboPrinter pozwala na skuteczne typowanie zarówno szczepów klinicznych jak i środowiskowych.
Metody oparte na PCR (PCR-rybotypowanie)
Jak opisano w skrypcie podstawowym problemem, który trzeba rozwiązać przy konstruowaniu metod z grupy RFLP jest znalezienie sposobu „wyłonienia” analizowanych fragmentów DNA z całości DNA komórkowego. Przy zastosowaniu techniki PCR problem ten rozwiązuje zastosowanie specyficznych primerów, które powodują specyficzną amplifikację wybranych fragmentów genomu. W przypadku rybotypowania amplifikować można następujące fragmenty operonu rrn:
a) region polimorficzny, znajdujący się pomiędzy genami kodującymi 16S i 23S rRNA (ISR),
b) region zmienny wewnątrz genu kodującego 16S rRNA,
c) całą sekwencję genu kodującego 16S rRNA ,
d) region obejmujący geny kodujące 16S i 23S rRNA oraz znajdujący się pomiędzy nimi fragment polimorficzny,
e) region kodujący tRNA.
4
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
BA RE CW01 ds1 cw0p0175 4 staje użyty do hybrydyzacji, jako sondę najczęściej stosuje się znakowany
BA RE CW01 ds1 cw0p0175 1 Materiały uzupełniające do skryptu Metody molekularne w diagnostyce mikro
BA RE CW01 ds1 cw0p0123 1 1. Wymienić wskazania do stosowania glikozydów nasercow
BA RE CW01 ds1 cw0p0175 6 Do celów badawczych prowadzi się bardzo szerokie prace, mające na celu oz
BA RE CW01 ds1 cw0p0123 2 1. Wskaż właściwy szereg związków od najsłabiej wchłani
BA RE CW01 ds1 cw0p0175 6 Do celów badawczych prowadzi się bardzo szerokie prace, mające na celu oz
BA RE CW01 ds1 cw0p0175 3 szaro w, określa się je jako „regiony hyperzmienne” (Vl-V9). Zmienne sekw
BA RE CW01 ds1 cw0p0175 7 PcęRl fcoRI Żca W 34,609 11,253 6,674 5,458 5,027 4,717 3,690 and 3 JOT 3
BA RE CW01 ds1 cw0p0175 8 kolonie analizowanych izolatów genomowe DNA amplifikacja
BA RE CW01 ds1 cw0p0175 2 rozdzielający geny rrs i rrl, oznaczany jako obszar polimorficzny lub ISR
BA RE CW01 ds1 cw0p0175 5 Produkty amplifikacji są rozdzielane elektroforetycznie i analizowane. W
więcej podobnych podstron