BA RE CW01 ds1 cw0p01755

Produkty amplifikacji są rozdzielane elektroforetycznie i analizowane. W każdym z tych wariantów możliwe jest wprowadzenie dodatkowego etapu, polegającego na trawieniu enzymami restrykcyjnymi, co często podnosi zdolności dyskryminacyjne metody.

ITS-PCR

ITS-PCR (ang. intergenic transcribed spacer PCR) jest metodą bardzo uniwersalną, znajdującą zastosowanie do badania bakterii bardzo wielu gatunków. Polega na amplifikacji polimorficznego regionu, znajdującego się między genami kodującymi 16S rRNA i 23S rR-NA, przy użyciu uniwersalnych primerów komplementarnych do bardzo silnie konserwowanych regionów genów rrs i rrl. Pierwszy primer znajduje się na końcu 3’ genu kodującego 16S rRNA, a drugi na końcu 5’ genu kodującego 23S rRNA (Rys. 3). Produkty PCR poddaje się analizie po rozdziale elektroforetycznym. Obserwuje się różną liczbę prążków odpowiadających fragmentom o różnej długości, co wynika ze zmiennej liczby kopii operonu rrn i ze zróżnicowania wielkości regionu polimorficznego. Dodatkowo produkty PCR mogą być trawione enzymem restrykcyjnym, co podnosi zdolność różnicowania metody. W większości przypadków metoda okazywała się przydatna do identyfikacji bakterii na poziomie gatunku. W przypadku Clostridium difficile, bakterii wywołującej rzekomobłoniaste zapalenie jelit, metoda ta pozwala na bardzo skutecznie różnicowanie szczepów tego gatunku. Wynika to stąd, że szczepy C. difficile posiadają 11 kopii operonu rrn, które różnią się wielkością fragmentu ISR, co daje zróżnicowane profile w analizie elektroforetycznej. Metoda daje w pełni powtarzalne wyniki i mimo że jest nieco mniej różnicująca niż elektroforeza pulsacyjna, to dzięki łatwości wykonania jest konkurencyjna w stosunku do PFGE.

Analiza genu kodującego 16S rRNA

Kolejną odmianą rybotypowania jest metoda ARDRA (ang. amplified ribosomal DNA restriction analysis). Polega ona na amplifikacji przy użyciu PCR całego genu kodującego 16S rRNA, produkt reakcji jest następnie trawiony enzymami restrykcyjnymi i analizowany na żelu. W metodzie tej analizowany jest cały obszar kodujący 16S rRNA razem z jego częściami hiperzmiennymi, technika ta jest więc bardzo skuteczna zarówno w identyfikacji gatunków jak i w rozróżnianiu szczepów bakterii. Jest przy tym stosunkowo prosta, nie wymaga stosowania trudnych i kosztownych etapów jak hybrydyzacja czy sekwencjonowanie.