img033

nad gatunkami towarzyszącymi. Odpowiednio dobrane pożywki wzbogacające pozwalają na wyizolowanie mikroorganizmów o różnych wymaganiach pokarmowych.

W celu dokonania oceny przydatności biotechnologicznej drobnoustrojów należy je, po wyizolowaniu i namnożeniu testować w postaci czystych kultur.

Zabiegi skriningowe mogą być znacznie usprawnione dzięki specjalnym testom z użyciem odpowiednich wskaźników lub substratów w podłożach powodujących pojawienie się wokół kolonii barwnych stref będących wskaźnikiem aktywności metabolicznej badanych szczepów. Przykładowo szczepy syntetyzujące enzymy amylolityczne można różnicować na podłożu z dodatkiem skrobi. Po zalaniu powierzchni płytki roztworem jodu (płynem Lugola) można zaobserwować wokół kolonii wytwarzających amylazy jasne strefy na granatowym tle, świadczące o rozkładzie skrobi przez wydzielone do podłoża enzymy amylolityczne.

Podłoża z dodatkiem kazeiny bądź odtłuszczonego mleka stosuje się do wykrywania zdolności proteolitycznej drobnoustrojów, którą obserwuje się w postaci jasnych stref wokół wyrosłych kolonii. W badaniach skriningowych stosuje się wiele chemicznie modyfikowanych barwnych substratów takich jak na przykład błękit dekstranowy, błękit celulozy, czy też lazurową skrobię ( blue-dekstran, blue cellulose, starch azure).

Zastosowanie w podłożu takiego barwnego substratu pozwala na szybką ocenę określonej zdolności enzymatycznej testowanego szczepu. Powodzenie skriningu zależy od jeszcze wielu innych nie opisanych czynników, a szczególnie od doświadczenia prowadzących go specjalistów.

2.    Materiały i odczynniki

•    roztwór jodu w jodku potasu

•    fizjoligiczny roztwór NaCI w kolbach i probówkach

•    próbki gleby

•    skosy agarowe

3.    Sprzęt

•    waga analityczna

•    pipety szklane

•    głaszczki szklane

•    płytki Petriego

•    ezy

•    łaźnia wodna

•    cieplarka

4. Wykonanie ćwiczenia

4.1. Izolowanie drobnoustrojów bytujących w glebie

a) Materiał do szczepienia:

• próbki gleby

b)    Podłoża:

•    podłoże bulionowe

•    podłoże Sabourand

c)    Odczynniki:

•    jałowy roztwór soli fizjologicznej do rozcieńczeń: 250 ml w kolbie i po 9 ml w probówkach.

Wykonanie

•    odważyć 25 g jednej z próbek gleby i przenieść do 250 ml jałowej soli fizjologicznej (rozcieńczenie 10x)

•    wytrząsać zawiesinę przez około 15 minut. Pozostawić do opadnięcia większych cząstek wykonać rozcieńczenia 10‘³, 1CT⁴, 10'⁵, 1CT⁶ , 10'⁷ w/g schematu:

Jml

•    z rozcienczen    , KT* , 10’⁷ wylać po 1 ml płynu na 4 płytki z każdego

rozcieńczenia    (O ¹

•    wszystkie płytki zalać ochłodzonym do 50°C podłożem wzrostowym (bulionowym i Sabourand). Dobrze wymieszać i pozostawić do zestalenia podłoża

•    płytki inkubować w temperaturze 28-30°C przez 3-7 dni. Po okresie inkubacji policzyć wyrosłe kolonie

•    sporządzić z różnych rodzajów kolonii preparaty barwione metodą Grama. Zwrócić uwagę na morfologię występujących form bakteryjnych.

5. Obserwacje makroskopowe posiewów na podłożach ze specyficznymi wskaźnikami

5.1. Proteolityczna aktywność bakterii glebowych