img034

użyć po 30 min po połączeniu składników). Próby pozostawić w temperaturze pokojowej na 10 minut. Następnie energicznie wstrząsając, dodać 0.2 ml odczynnika Folina-Ciocalteu. Po 30 minutach inkubacji w 37°C zmierzyć absorbancję prób w aparacie "Specol" przy długości fali X=650 nm, wobec próby odczynnikowej, zawierającej zamiast badanego roztworu białka wodę. Obliczyć ilość rozpuszczalnego, uwolnionego z piór białka, korzystając z krzywej wzorcowej.

3.1.2.2. Oznaczanie ilości grup sulfhydrylowych obecnych w

^LU^łę^PUS/^'^nyCWi^^^{adaCjikeratyn}

Wygodną i czulą metodą oznaczania zawartości grup sulfhydrylowych w białkach jest spektrofotometryczny pomiar, opracowany przez Boyera. Podstawą tego oznaczenia jest specyficzna reakcja grup sulfhydrylowych z organicznymi związkami rtęci, w wyniku której powstaje trwały związek - merkaptyd. Wykazuje on znacznie wyższe spektrum absorpcji aniżeli zastosowane w' reakcji odczynniki.

Sposób oznaczenia

i •

0.1 nil odpowiednio rozcieńczonego filtratu lub ekstraktu hodowli promieniowca na piórach (p.3.1.2.) uzupełnić 3. ml 0 33 M buforu octanowego o pH 4 6. Następnie dodać 0.1 ml 1.92 mM roztworu kwasu p-chlorortęciobenzoesowego (pCMB). Po 15 min reakcji w temperaturze pokojowej dokonać pomiarów' ekstynkcji na spektrofotometrze, przy długości fali X=250 nm. Równolegle do prób właściwych wykonać próbę odczynnikową, zawierającą 3.1 ml buforu octanowego i 0.1 ml pCMB. Obliczyć przyrost substancji sulfhydrylowych, korzystając z krzywej wzorcowej sporządzonej dla L-cysteiny.

3.2. Badanie aktywności preparatu pozakomórkowych proteinaz S.fradiae wobec piór kurcząt

Metoda oznaczania aktywności enzymów w'obec nierozpuszczalnych substratów keratynowych polega na pomiarze ilości uwolnionego, rozpuszczalnego białka. Zawartość białka w filtratach mieszaniny reakcyjnej oznaczyć metodą Low'ryego, przedstawioną w pukcie p 3.1.2.1.

Skład mieszaniny reakcyjnej

^Tml £5 mM buforu boranowego o pH 8.5 ; 0.5 ml 1 mM roztworu MgCI₃; 3.5 ml H₂0 oraz 200 mg rozdrobnionych piór i 1 ml roztworu preparatu enzymatycznego. Mieszaninę inkubować 2 godziny w 37°C, po czym przesączyć. Równolegle wykonać dwie próby kontrolne: jedną zawierającą wszystkie składniki mieszaniny reakcyjnej z wyjątkiem enzymu oraz drugą zawierającą wszystkie składniki z wyjątkiem substratu. W filtratach odpowiednio inkubow’anych prób oznaczyć zawartość rozpuszczalnego białka. Aktywność keratynolityczną preparatu enzymatycznego wyrazić w mg rozpuszczalnego białka uwolnionego z piór kurcząt w warunkach testu j

Wyniki ćwiczenia opracować w formie sprawozdania, które powinno zawierać krótką część wstępną (teoretyczną) oraz omówienie,rezultatów wykonanych analiz.

Ću\eiENIE b.

PROCESY BIODEGRADACJI W OCHRONIE ŚRODOWISKA LABORATORIUM

ĆWICZENIE NR 4

BIODEGRADACJA SKLEROPROTEIN

1. Wprowadzenie

^Śkleroproteiny, inaczej białka strukturalne lub fibrylame (włóki en ko we), występują u wyższych organizmów, jako główny składnik tkanki podporowej; łącznej i okrywowej. Charakteryzują się one nierozpuszczalnością oraz wysoką odpornością zarówno na działanie enzymów proteolitycznych, jak i czynników chemicznych. Ich wyjątkowa stabilność związana jest z nadzwyczaj skomplikowaną włókienkową strukturą, utrwaloną licznymi wiązaniami wodorowymi, hydrofobowymi bądź kowalencyjnymi. Typowymi przedstawicielami skleroprotein są:

•    keraj^yny, białka tworzące zewnętrzną warstwę skóry oraz jej przydatki, takie jak: włosy, paznokcie, pióra, sierść, rogi, kopyta itp.

•    elastyna i kolagen, występujące w mięśniach, ścięgnach, wiązadłach i głębszych warstw-ach skóryy

Spośród wymienionych białek, keratyny stanowią podstawowy składnik gromadzonych w dużych ilościach ubocznych produktów (pióra, sierść, rogi czy kopyta) wielu gałęzi przemysłu spożywczego. Te odpadowe substancje białkowe, ze względu na wysoką odporność enzymatyczną oraz chemiczną, nie są utylizowane przez organizmy zwierzęce i pozostają na ogół nie zagospodarowywane. W celu zwiększenia przyswajalności keratyn (głównie piór drobiu) oraz wykorzystania ich jako dodatku do konwencjonalnej paszy stosuje się, choć w niewielkim zakresie, obróbkę surowca- chemiczną (z udziałem mocznika lub niektórych polarnych rozpuszczalników) albo termicznąTńpTuparowanie). Procesy le powodują jednak destrukcję~ńielćtórycfr cennyćfT~aminokwasów i wymagają znacznej ilości energii. Wiadomo natomiast, że istnieją w przyrodzie pew-ne szczepy drobnoustrojów, posiadające zdolność rozkładu natywnych keratyn. Keratynolityczną aktywność, poza dermatofitami- patogenami skóry, przejawiają: bytujące w glebie keratynofilne grzyby, niektóre szczepy promieniowców oraz bakterii właściwych. Biodegradacja z zastosowaniem mikroorganizmów' wyposażonych w keratynolityczne enzymy mogłaby więc stanowić bardziej efektywną, aniżeli procesy chemiczne czy fizyczne, metodę utylizacji tych odpadów.

Ćwiczenie stanowi ilustrację wykorzystania keratynolitycznego szczepu Streplomyces oraz preparatu jego pozakomórkowych enzymów do degradacji piór kurcząt.