IMG 1211261722

LMit innktvcfflni

L. Oni ml unie preparatów trwałych pozwala lacvch łioli»nvBw< omanrllr komórkowe otoc/onc polcdyncza Mona lub lukalfcaclc spccyfle/nych illn nich CBŁYIIIÓW.

n) pyl węglowy w innkrofagnch płucnych

b)    npnrat Oolglego w komórkach zwojów przy kręgowych

c)    kwaśna fosfataza w komórkach kanalików nerkowych

d)    fosfataza zasadowa w rąbku szczoteczkowym kanalików nerki

2. Obserwacja Iłrosomów w komórkach ze skórki laski spichrzowej cebuli barwionych oranżeni akrvdvnv.

a)    Fragmenty cpidermy łuski spichrzowej cebuli (z wewnętrznej strony) i przekroje poprzeczne młodych korzeni cebuli przepłukać w wodzie.

b)    Materiał umieścić umieścić na szkiełku podstawowym w kropli oranźu akrydyny i obserwować w mikroskopie fluorescencyjnym.

Oranż akrydyny fluoryzuje tylko w kwaśnym środowisku. Barwa fluorcscencji zależy od pH środowiska. W lizosomach fluoryzuje on na kolor pomarańczowy, a w jądrze komórkowym na jasno zielony.

W cytoplazmie komórki nie obserwuje się fluorescencji.

3. Wykrywanie aktywności Dcroksvdazv — enzymu dnniktcrVttYcam»dł> peroksysomów i ziarnistości granulocytów.

Pcroksydazy podobnie jak katalazy, sążdazoporfliynami katalizującymi reakcje utleniania:

Peroksydaza + Hj 0₂ + substrat Hi -> peroksydaza - utleniony substrat - H_; O

Przy cytochemicznej metodzie oznaczania tego enzymu używa się, w charakterze substratu, 3,3 - dwuaminoben2ydyny (DAB). Pod wpływem utleniania ulega ona polimeryzacji pozostając ściśle związana z utleniającym hemoproteidem. Brunatne zabarwienie polimerów pozwala lokalizować aktywność peroksydaz na poziomie mikroskopu świetlnego.

Odczynniki:

Odczynnik peroksydazowy;

•    Do 30 ml 40 % etanolu dodać kilka kryształków benzydyny i mieszać przez kilka minut (powstanie roztwór nasycony).

•    Przesączyć przez gazę, a do przesączu, na każde 10 ml dodać 0.02 ml H_:Oj. Roztwór jest nietrwały.

WyKonwjnuMkfiii'    _.    .    .

*) rngm«nty cpidermy łuski spichrzowej cebuli (z wewnętrznej strony) i przekroje poprzeczne młodych korzeni cebuli przepłukać w wodzie,

b)    Materiał umictoi w 10 ml odczynnika perofcsydazowego na 10 minut, w temperaturze pokojowa)

c)    Spłukać wodą

,i) Umiejcie na szkiełku podstawowym w kropli glicerolu i obserwować w mikroskopie iwictlnym

4. riuorescencYlm metoda badania oksydoredukcyinych właściwości żywych Komórek z zastosowaniem błękitu Nilu I siarczanu błękitu Nilu.

Mleku Nilu me jest fluorochromem. ale fluoreacencję daje jego forma zredukowana. Proatym sposobem redukowania błękitu Nilu jest dodanie do jego roztworu siarczanu sodu V>.) Produkiem reakcji jest siarczan blekitn Silu dający fluorescencję żółtą.

'a /ywych. metabolicznie aktywnych komórkach zachodzą procesy oksydoredukcyjne, w ibcc zcc<> błękit Silu podany do komórki może alce redukcji. Zaadsorbowany w formie zredukowanej na tłuszczach obojętnych daje fluorescencję zioóstozołta.

Odczynniki:

Błękit Nilu - wodny roztwór w rozcieńczeniu 1:40 000 o pH 7-8 Wykonanie reakcji:

•    Wykonać 2 preparaty ze skórki wewnętrznej strony łuski spichrzowej cebuli (lub Hmmandms):

a)    w kropli wody w celu zbadania autofluorescencji materiału

b)    w kropli błękitu Nilu

uwaga: w preparacie błękit Nilu musi ulec redukcji w żywych, aktywnych metabolicznie komórkach. Reakcja ta jest aktywowana przez światło niebieskie w zakresie 470 - 490 nm. Czas oczekiwania na pojawienie się fluorescencji wynosi zależnie od rodzaju obiektu 1 -60 minut.

•    Przeprowadź obserwacje w mikroskopie fluorescencyjnym zwracając uwagę na fluorescencję ciał olejowych (sferosomów).

•    Określić czas pojawienia się fluorescencji we wszystkich preparatach, opisać wyniki i wyciągnąć wnioski.