IMG 14

6. Podstawy technologii wybranych bioproduktów

6.4.2.

Otrzymywanie preparatów lipaz

Lipazy (hydrolazy acyloglicerolowe EC 3.1.1.3) mikroorganizmów cechuje ogromna różnorodność w zależności od drobnoustroju, warunków hodowli i działania oraz od specyficzności. Chociaż danych dotyczących warunków hodowli mikro* organizmów-nadproducentów lipaz w skali laboratoryjnej jest bardzo dużo. to ze zrozumiałych względów brakuje danych dotyczących ich przemysłowej biosyntezy. Synteza lipaz metodami hodowli powierzchniowej lub wgłębnej jest najczęściej prowadzona w 30-50°C przez Rhizopus airhizus, Aspergillus niger, Rhizomucor miehei, Candida rugosa w pożywce o pH 6-9 zawierającej mono-

lub polisacharydy, mąkę sojową, glicerol, pepton, siarczan(VI) amonu oraz olej z oliwek lub tributyrynę. Wydajność procesu i właściwości enzymów są doskonalone metodami międzyrodzajowej fuzji chemicznej i elektrofuzji wybranych drobnoustrojów oraz metodami inżynierii genetycznej.

Większość lipaz mikrobiologicznych jest enzymami zewnątrzkomórko-wymi. Tradycyjne metody oczyszczania lipaz są często kłopotliwe, mało wydajne i czasochłonne. Do alternatywnych technologii zalicza się procesy membranowe, wodne systemy dwufazowe i immunooczyszczanie. Ciecz pofermentacyjna po oddzieleniu biomasy przez filtrację lub wirowanie jest zagęszczana metodą ultrafiltracji lub enzym jest z niej wytrącany siarczanem(VI) amonu, rozpuszczalnikami organicznymi (etanol, aceton) lub kwasem (najczęściej solnym). Procesy membranowe stosuje się zarówno do oddzielania biomasy, jak i do zagęszczania cieczy pofermentacyjnej zawierającej lipazy. Wydajność wstępnego oczyszczania, tj. wytrącania „surowego” enzymu, wynosi ok. 87%. Wytrącanie można stosować w kombinacji z metodami chromatograficznymi, najczęściej z chromatografią na żelu i chromatografią powinowactwa. „Surowe” preparaty lipaz są oczyszczane metodami chromatograficznymi, przy czym pojedynczy etap chromatografii nie zawsze gwarantuje wymaganą czystość. Dlatego często stosuje się kolejno kilka metod chromatograficznych, najczęściej chromatografię jonowymienną (np. przy użyciu amonitów z grupami dietyloaminoetylu (DEAE) tnetyloaminoetylu. Q-Sepharose, kationitu z grupą karboksymetylocelulozy), cję na żelu, chromatografię powinowactwa, chromatografię oddziaływań fobowych (z hydrofobowymi adsorbentami z grupami oktylu lub fenylu), iografię adsorpcyjną (z hydroksyapatytem). Chociaż metodą powinowac-ożna zwiększyć współczynnik oczyszczenia lipaz od 2 do 10, to ze wzglę-onomicznych we wczesnych etapach oczyszczania lipaz, tj. po ickwytrą-stosowane metody wymiany jonowej i filtracji na żelu. Ta ostatnia ‘ i również stosowana w końcowym etapie oczyszczania enzymu -- lipaz z wydajnością ok. 30%, tak aby współczynnik oczyszczenia Mtymaga 4 lub S etapów. Duże nadzieje rokuje imniMflooczysz-iem specyficznych, zazwyczaj monoklonalnych, przeciwciał

I lililonalnych przeciwciał oczyszczonych metodą powinowactwa, które M ^Edukowane w przemysłowej skali, a ich cena systematycznie maleje.

wodne układy dwufazowe, najczęściej glikol polietylenowy (PEG) fj_cksttan lub układy polimery/sole (PKG/siarczan<VI) magnezu. PEG/fosforan tfawk *4 przydatne do oczyszczania lipaz. np. nieoczyszczoną lipazę Rhizo-0trmthei oczyszczano dwuetapowo, odzyskując po ok. 60 mm ponad 80% ^inu o czystości 69%. W pierwszym etapie lipaza była ekstrahowana do gór* juj fazy układu (3,3% mas. PEG 6000.15% fosforanu sodu. 1.9% NaCl, pH 3.4). a w drogim ekstrahowana z górnej do dolnej fazy po dodaniu 7% mas. fosforanu o pH 6,3,1% NaCl i 42% wody.

6.4.3.

Otrzymywanie preparatów proteaz

Bakteryjne preparaty koagulujące mają małą przydatność z powodu dużej aktywności proteolitycznej, znacznie zmniejszającej wydatek sera i pogarszającej jego cechy organoleptyczne. Preparaty proteaz o dużej aktywności koagulującej otrzymano z bakterii: Bacillus polymyxa (preparat Milcozyme. Godo Shuesi Co . Ud), B. mesentericus, B. cereus, B. subtilis. Protcazy koagulujące białka mleka, zwłaszcza zewnątrzkotnórkowe, syntetyzowane przez grzyby strzępkowe charakteryzują się korzystniejszym stosunkiem aktywności koagulującej i proteolitycznej w porównaniu do enzymów bakteryjnych. Do przemysłowej produkcji substytutów podpuszczki są stosowane: mezofilny szczep Cryphonectria para-silica (Endothia parasitica) - preparaty: Suparen i Surę Curd. Pfizer International. Stany Zjednoczone; termofilne szczepy Rhizomucor miehei (Mucor miehei) -preparaty: Morcural, Pfizer International, Stany Zjednoczone; Fromase, Gist Brocades, Holandia; Hannilase, Chr, Hansen's Laboratory, Inc., Dania: Rennilase, N0V0 Industries A/S, Dania; Marzyne. Miles Laboratories. Inc.. Stany Zjednoczone - i Rhizomucor pusillus (Mucor pusillus) var. Lindt - preparaty: Emporase. Dairyland Food Laboratories, Stany Zjednoczone; Meito MR. Meito Sangyo. Japonia; Noury Rennet, Vitex, Wielka Brytania. Przemysłowa biosynteza prote-az koagulujących przy użyciu wspomnianych grzybów jest prowadzona w warunkach hodowli wgłębnej wstrząsanej w pożywce zawierającej mąkę sojową, glukozę, hydrolizaty skrobiowe, sole mineralne oraz rzadziej serwatkę łub białka mleka. Rhizomucor pusillus najwydajniej syntetyzuje enzymy koagulujące w podłożu półstałym, którego głównym składnikiem są otręby pszenne. Preparaty enzymów zewnątrzkomórkowych są otrzymywane z cieczy pofermentacyjnej po oddzieleniu grzybni metodami filtracji lub wirowania, a enzymów wewnątrzkomórkowych - z supernatantu po odwirowaniu grzybni zdezintegrowanej metodą chemiczną (aceton o temp. od -15°C do -20°C), mechaniczną, mechamczno-ciś-meniową lub ciśnieniową. Najczęściej do wyodrębnienia proteaz koagulujących stosuje się koncentrację cieczy pofermentacyjnej lub supernatantu przez odpa-

403