IMG 22

6. Podstawy technologii wybranych bioproduktów

prawdopodobieństwem założyć, że już wkrótce komórki tych mikroom • staną się doskonałą ..fabryką" produkującą w dużych ilościach nowe. biolo'S* aktywne i cenne - z ekonomicznego punktu widzenia - polipeptydy.

Procesy jednostkowe stosowane w technologii

wybranych leków białkowych

Insulina. Insulina jest polipeptydem z grupy albumin składającym się z dwóch łańcuchów, krótszego łańcucha A zbudowanego z 21 aminokwasów oraz dłuż. szego łańcucha B zawierającego 30 aminokwasów, połączonych dwoma mostkami dwusiarczkowymi. Jedno wiązanie dwusiarczkowe powstaje z udziałem cysteiny łańcucha A (położenie 7) i cysteiny w położeniu 7 łańcucha B, a drugie tworzy się z udziałem cysteiny w położeniu 20 łańcucha A oraz cysteiny w po. łożeniu 19 łańcucha B. Ponadto w łańcuchu A występuje trzeci mostek dwu-siarczkowy łączący cysteinę w położeniu 6 z cysteiną w położeniu 11.

Brak insuliny lub jej niedobór jest przyczyną poważnych zaburzeń przemiany sacharydów, a w konsekwencji także białek i tłuszczów. Insulina zmniejsza stężenie glukozy w surowicy krwi i nasila jej spalanie, wzmaga syntezę gli-kogenu i peptydów w wątrobie, a także hamuje glukoneogenezę z aminokwasów i intensyfikuje syntezę wolnych kwasów tłuszczowych.

Do niedawna insulinę otrzymywano metodą ekstrakcji z trzustek zwierzęcych lub metodą półsyntetyczną polegającą na enzymatycznym przekształceniu insuliny wieprzowej w insulinę ludzką (tzw. humanizowaną HM), poprzez wymianę końcowego aminokwasu - alaniny - łańcucha B insuliny wieprzowej w położeniu 30 na L-treoninę. Metodą inżynierii genetycznej uzyskano insulinę humanizowaną określaną jako insulinę ludzką rekombinowaną przez biosyntezę w komórkach E. coli (metoda prb) lub S. ceremiae (metoda pyr), które są odpowiednio transformowane dzięki wprowadzeniu genu proinsuliny ludzkiej lub też genów łańcuchów A i B insuliny ludzkiej. Z proinsuliny insulina jest otrzymywana po enzymatycznym (z udziałem trypsyny i karboksypeptydazy) od-szczepieniu łańcucha C. W drugim rozwiązaniu skonstruowano dwa szczepy mikroorganizmów wytwarzające odpowiednio łańcuchy A i B, które należy przeprowadzić w S-sulfonowe pochodne, a następnie połączyć metodami chemicznymi (tioliza i utlenienie) w cząsteczkę aktywnego hormonu. Ludzka insulina (Humulin) firmy Elli Lilly była pierwszym lekiem produkowanym metodą inżynierii genetycznej wprowadzonym na rynek w 1982 r. Biosynteza ludzkiej insuliny jest klasycznym przykładem nowych technologii, dobrze opisanym w piśmiennictwie biotechnologicznym i dlatego pominięto tutaj szczegóły dotyczące klonowania i warunków bioprocesu. Bardzo ważnym procesem technologicznym zapewniającym właściwą jakość preparatu oraz jego pełną aktywność fizjologiczną jest oczyszczanie insuliny. Odpowiednio oczyszczona insulina wywołuje mniej działań niepożądanych, np. rzadziej powoduje reakcje aler-

| giczne. Po oddzieleniu biomasy metodą wirowania lub filtracji (w przypadku I bakterii jest wymagana dodatkowo dezintegracja, gdyż insulina jest metabolitem I wewnątrzkomórkowym) pożywka jest zobojętniana i zagęszczana w próżni.

I a surowa insulina wysałana w punkcie izoelektrycznym i krystalizowana z dodatkiem soli cynku. Preparat po kilkakrotnej krystalizacji zawiera HO 90% insuliny

Dalsze oczyszczanie odbywa się z udziałem metod chromatograficznych.

| sączenia molekularnego (na żelach polidekstranowych) oraz elektroforezy f /a-steczki naturalnej insuliny przechowywanej w stężeniach stosowanych w terapii wykazują tendencję do asocjacji Insulina z aminokwasami zmodyfikowanymi w C-końcowym fragmencie łańcucha B ma ograniczoną zdolność do asocjacji, dzięki czemu szybciej przenika do układu krążenia po podaniu przez iniekcje, umożliwiając stosowanie leku bezpośrednio przed posiłkiem. Przykładami tego typu leków są: Humanolog (Insulin lispro. E. coli), w którym lizyna i prolina (położenie 29 i 28 łańcucha B) zostały wprowadzone w odwrotnej kolejności; Liprolog (Bio Lysprol, E. coli) i NovoRapid (Insulin aspart). w których prolinę w położeniu 28B zastąpiono asparaginą; Lantus (Insulin glargine. E. coli), w którym zamiast asparaginy w położeniu 21A występuje glicyna, a łańcuch B dodatkowo zawiera dwie cząsteczki argininy w położeniu 31 i 32.

W 1992 roku w Instytucie Biotechnologii i Antybiotyków w Warszawie podjęto prace nad biosyntetyczną insuliną, które zostały uwieńczone zarejestrowaniem w Polsce rekombinowanej insuliny pod nazwą Gensulin. Produkcję preparatów rekombinowanej insuliny uruchomiono w Macicrzyszu k. Warszawy. Jest ona wytwarzana w dwóch podstawowych postaciach farmaceutycznych: Gensulin R (roztwór) i Gensulin M (izofanowa zawiesina protaminowa). Złożone preparaty Gensulin M (MIO. IW20, M30, M40. M50; zakres 10-50 określa procentową zawartość insuliny w roztworze) przyrządza się. mieszając w sterylnych warunkach odpowiednie ilości izofanowej zawiesiny protaminowęj i roztworu insuliny.

Do otrzymywania rekombinowanej insuliny zastosowano szczep £ coli transformowany plazmidem z fragmentem DNA kodującym zmodyfikowany prekursor ludzkiej insuliny składający się z łańcucha B i dipeptydu łączącego łańcuch A insuliny. Sekwencja DNA kodująca prekursor jest dołączona do zmodyfikowanego fragmentu genu ludzkiej dysmutazy. Biomasa komórek £. coli, zawierająca białko fuzyjne - mini-pre-mini-proinsulinę - syntetyzowane w postaci nierozpuszczalnych ciałek inkluzyjnych, jest oddzielana od pożywki metodą wirowania lub filtrowania, a następnie dezintegrowana metodą enzymatyczną. Wyizolowane białko fuzyjne jest rozpuszczane w celu odtworzenia przestrzennej konformacji charakterystycznej dla natywnego białka. Z odpowiednio zmodyfikowanego chemicznie białka fuzyjoego po enzymatycznej I konwersji, w czasie której zostaje oddzielony peptyd dysmutazy i peptyd A insuliny, otrzymuje się preparat różniący się od ludzkiej insuliny obecnością dwóch dodatkowych aminokwasów na C-końcu łańcucha B.

467