0
1

usunięcia produktów utleniania mogących powodować przerwanie wiązania fos-fodiestrowego. Fenol wykorzystywany bezpośrednio do ekstrakcji powinien mieć pH lekko alkaliczne, bliskie 8 (koniecznie większe od 7,8), aby zmniejszyć oddziaływanie elektrostatyczne kwasów nukleinowych z jonami, w przeciwnym razie DNA może się znaleźć w fazie organicznej.

7)    Bufor ekstrakcyjny można sporządzać z buforu stężonego: 1 M Tris/HCl (pH 8,0) - 0,5 M EDTA, do którego po rozcieńczeniu należy dodać sproszkowany SDS, i przechowywać w porcjach, np. po 50 ml, w temp. 4°C do 3 miesięcy. Detergent anionowy ułatwia oddysocjowanie białek od kwasów nukleinowych (podobnie działają sole o wysokim stężeniu). Czynniki chelatujące usuwają wielowar-tościowe metale, które mogą tworzyć sole z grupami fosforowymi kwasów nukleinowych.

8)    Roztwór proteinazy K o stężeniu 10 mg/ml może być przechowywany w temp. -20°C, rozmrażany przed użyciem, a następnie zamrażany ponownie.

Ćwiczenie 10.2. Izolowanie DNA z pełnej krwi uproszczoną metodą ekstrakcji fenolowej (C.C. Albarino, V. Romanowski, 1994: Mol. Celi. Probes, 8:423-427)

Zasada: Mechanizm ekstrakcji jest taki sam jak w ćw. 10.1. Jednakże najwyższą wydajność zapewnia trawienie proteinazą K przeprowadzane przez co najmniej 12 godz., wobec czego taka procedura na ogół trwa dłużej niż jeden dzień. Często jest konieczne otrzymanie DNA w znacznie krótszym czasie, co można osiągnąć stosując opisaną dalej metodę, która ma dodatkowo tę zaletę, że próbka krwi ulega inaktywacji pod względem potencjalnego zagrożenia biologicznego.

Materiał: Krew.

Odczynniki:

1)    Fenol o pH 8,0 (przygotowanie fenolu jak w ćw. 10.1).

2)    Mieszanina: fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (obj. 25:24:1).

3)    Chloroform.

4)    96% roztwór etanolu.

5)    70% roztwór etanolu.

Aparatura: Mikrowirówka.

Wykonanie:

1.    Pobrać krew bez użycia antykoagulantu; 500 pl krwi dodać do probówki

0    pojemności 1,5 ml zawierającej fenol (odcz. 1) i energicznie wymieszać. Jest to etap inaktywacji krwi, po którym próbkę można przechowywać w temperaturze pokojowej co najmniej przez kilka godzin, do czasu wykonania dalszych etapów.

2.    Odwirować (13000 xg w temp. pokojowej przez 5 min). Zebrać fazę wodną

1    przeprowadzić ekstrakcję mieszaniną: fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (odcz. 2), a następnie chloroformem.

3.    Wytrącić DNA z ok. 300 pl fazy wodnej otrzymanej po ostatniej ekstrakcji

2    objętościami 96% roztworu etanolu (odcz. 4) i odwirować (13 000 xg w temp. pokojowej, 10-30 min).

4.    Osad płukać 70% roztworem etanolu i rozpuszczać w 100 pl wody lub buforu TE.

371