0
9

7.    Odwirować jak w etapie 4., starannie usuwając jak największą ilość etanolu.

8.    Powtórzyć etapy 6. i 7.

9.    Suszyć próbkę w aparacie próżniowym do zupełnego wyparowania etanolu.

10.    Dodać 100 pl buforu do trawienia zawierającego proteinazę K (odcz. 3).

11.    Inkubować w temp. 55°C przez 3 godz., krótko odwirować dla usunięcia cieczy z górnej części probówek.

12.    Inkubować w temp. 95°C przez 8-10 min w celu inaktywacji proteinazy K.

13.    Przechowywać preparat w temp. — 20°C.

Uwagi:

1)    Jeżeli jest to możliwe, przed sporządzaniem skrawków należy usunąć z bloków nadmiar parafiny.

2)    Aby uniknąć przeniesienia zanieczyszczeń pomiędzy próbkami, wszystkie narzędzia do wykonywania próbek należy dokładnie myć ksylenem między operacjami wykonywanymi na różnych blokach.

3)    Usuwając supernatant (etap 4.) należy się posługiwać pipetą pasterowską, najlepiej podciśnieniową. Bardzo stare lub kruche tkanki ulegają fragmentacji podczas usuwania parafiny, należy więc zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć straty materiału.

4)    Aby uniknąć zanieczyszczenia próbek podczas suszenia (etap 9.), można zakryć probówki folią (np. typu Parafilm) i zrobić w niej kilka otworów.

5)    W przypadku dużych próbek należy zwiększyć objętość dodawanego buforu do trawienia (odcz. 3) do 200 pl (etap 9.).

6)    Nie należy przekraczać 10 min inkubacji inaktywując proteinazę K (etap 11.).

7)    Amplifikacja metodą PCR przynosi zazwyczaj znacznie lepsze rezultaty, gdy używa się próbek bezpośrednio po izolowaniu, niż próbek zamrażanych i rozmrażanych.

10.1.2. Izolowanie wysokocząsteczkowego i niskocząsteczkowego DNA

Izolowanie wysokocząsteczkowego DNA nie może być dokonane z zastosowaniem konwencjonalnych metod ze względu na bardzo dużą podatność takiego DNA na uszkodzenia, która jest konsekwencją dużej wartości stosunku długości do średnicy heliksu takiego DNA; np. najmniejszy z ludzkich chromosomów, chromosom 21, ma wielkość około 50 Mpz. Cząsteczka DNA tego chromosomu ma długość 15 mm i średnicę heliksu 20 nm, co sprawia, że stosunek długości do średnicy wynosi około miliona.

Ćwiczenie 10.9. Izolowanie wysokocząsteczkowego DNA z krwi (J.E. Nelson, S.A. Krawetz 1992: Anal. Biochem., 207:197-201)

Zasada: W metodzie tej wykorzystuje się działanie destabilizujące i denaturujące izotiocyjanianu guanidyny na makrocząsteczki, w tym enzymy trawiące DNA. Cząsteczki DNA rozpuszczone w roztworze izotiocyjanianu guanidyny można z niego wytrącić używając alkoholu izobutylowego. Opisana metoda, oprócz

379