09

5.    Rozdrobnić osad zawierający RN A w 3 M roztworze LiCl (odcz. 10) i odwirować (11000x0 w temp. 4°C przez 15 min). Zamrozić osad w temp. — 70°C, a następnie rozmrażać go energicznie wytrząsając i dodając jednocześnie 100 pl buforu solubili-zacyjnego (odcz. 11).

6.    Ekstrahować RNA 2-krotnie fenolem oraz 2-krotnie chloroformem. Doprowadzić do stężenia jonów sodu równego 0,3 M, dodając 3 M roztworu CH₃COONa (odcz. 12). Wytrącać RNA 2,5 objętościami etanolu (odcz. 7) i płukać 2-krotnie 70% roztworem etanolu.

7.    Rozpuszczać RNA w H₂0.

Uwagi:

1)    Zamiast krwi można używać komórek pochodzących z hodowli (świeżych lub mrożonych); należy wówczas rozpocząć preparatykę z 2-4-10⁶ komórek.

2)    Według oryginalnej procedury do izolowania limfocytów używa się preparatu Lymphoprep, produkcji norweskiej firmy Nyegaard, a RNA należy zamrozić w ciekłym azocie.

10.2. BADANIE WŁAŚCIWOŚCI KWASÓW NUKLEINOWYCH

10.2.1. Niektóre właściwości fizyczne i chemiczne kwasów nukleinowych

Współczesne analizy kwasów nukleinowych dotyczą głównie ich struktury, warunkującej udział tych makromolekuł w ekspresji informacji genetycznej. Obok tych molekularnych metod stosuje się, zwłaszcza w analizie jakościowej i ilościowej kwasów nukleinowych, metody oparte na podstawowych właściwościach fizykochemicznych tej grupy związków. Niektóre z tych właściwości ilustrują podane ćwiczenia.

Ćwiczenie 10.16. Rozpuszczalność kwasów nukleinowych

a)    Do 0,5 ml 0,1% roztworów RNA lub DNA dodać kroplami 0,1 M roztwory HC1 lub HC10₄. Wytrącają się osady kwasów nukleinowych. Po dodaniu roztworów NaOH, KOH lub amoniaku osady ulegają ponownemu rozpuszczeniu. Powtórzyć doświadczenie stosując 0,1 M roztwór CH₃COOH.

b)    Do 1 ml 0,1% roztworów RNA lub DNA dodać 2-krotną objętość 96% etanolu, wytrącają się osady kwasów nukleinowych.

Kwasy nukleinowe, z racji wielkości cząsteczek, tworzą w roztworach wodnych układy koloidowe, a dzięki dużej zawartości reszt kwasu fosforowego mają odczyn kwasowy. Dlatego też rozpuszczają się dobrze w środowisku zasadowym, trudniej w H₂0 i rozcieńczonych roztworach CH₃COOH. Silne obniżenie pH roztworu lub dodanie czynników odwadniających doprowadza do odwracalnego wytrącania kwasów nukleinowych.

389