01

trzeba wykonać chromatografię wzorcowych roztworów dC (lub wybranego nukleo-zydujoraz chromatografię mieszaniny deoksynukleozydów. Na podstawie przygotowanej krzywej kalibracyjnej do oznaczeń dC (wybranego nukleozydu) określić jej,/jego dokładne stężenie w mieszaninie 4 nukleozydów.

10.3. ANALIZA ILOŚCIOWA I STRUKTURALNA KWASÓW NUKLEINOWYCH

10.3.1. Analiza Ilościowa kwasów nukleinowych

Aby ilościowo oznaczyć zawartość kwasów nukleinowych w preparatach, powszechnie stosuje się metody, które można podzielić na dwie klasy: spektrofotometryczne i fluorescencyjne. Jeżeli preparat nie jest w znacznym stopniu zanieczyszczony białkami, fenolem, agarozą i innymi substancjami, to można zastosować metody spektrofotometryczne oparte na absorpcji promieniowania IJV. Kiedy zawartość DNA lub RNA w^f próbce jest bardzo mała lub próbka zawiera dużo zanieczyszczeń, stosuje się metody fluorescencyjne, oparte na pomiarze natężenia światła emitowanego przez fluorofor, najczęściej bromek etydyny, związany z kwasami nukleinowymi.

Ćwiczenie 10.33. Oznaczanie ilości i czystości preparatów kwasów nukleinowych przez pomiar absorbancji w obszarze maksymalnego pochłaniania UV (J. Sambrook i wsp. 1989: Mołecular clon i fig. A laboratory manuał. Book 3. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, E.5-E.7)

Zasada: W celu oceny zawartości DNA lub RNA należy dokonać pomiaru absorbancji próbek przy długości fali 260 nm i 280 nm. Pomiar przy A = 260 nm pozwala na ocenę zawartości kwasów' nukleinowych w próbce. Absorbancja jednostkowa przy długości drogi optycznej l cm odpowiada w przybliżeniu stężeniu 50 pg/ml dwuniciowcgo DNA, 40 pg/ml jednoniciowego DNA lub RNA oraz 20 pg/ml jednoniciowych oligonukleotydów. Stosunek wartości absorbancji przy /. = 260 i 280 nm f4₂₆oA428o) J^cst kryterium czystości kwasów nukleinowych. Czyste preparaty DNA i RNA powinny charakteryzować się wartościami A₂₆₀/A_2H0 odpowiednio l,8 i 2,0. Przy zanieczyszczeniach białkami lub fenolem wartości stosunku absorbancji będą niższe. Wówczas nie należy dokonywać pomiaru ilości kw^fasów^f nukleinowych metodą opartą na pomiarze absorbancji przy ). = 260 nm.

Yliiteritfc Preparat DNA lub RNA.

Odczyinik: Bufor TE (pH 8.0): I0 mM Tris/HCI - I mM EDTA.

Aparatura: Spektrofotometr pozwalający dokonywać pomiary w świetle UV, wraz z kuwetami kwarcowymi.

Wykonanie:

l. Rozcieńczyć preparat DNA lub RNA do wartości stężenia dającego wartość absorbancji leżącą w zakresie stosowanego spektrofotometru.

431