08

Wykonanie:

1.    Sporządzić 30% roztwór akrylamidu przez zmieszanie 29 g akrylamidu (odcz. i 1 g N,N'-metyIenoWsakrylamidu (odcz. 2) oraz dodanie H₂0 do 100 ml. Ogrzcv mieszaninę w temp. 37°C do rozpuszczenia składników.

2.    Sporządzić 10% roztwór (NH₄)₂S₂0₈ przez dodanie, do 1 g odcz. 4, wody 10 ml.

3.    Przygotować płyty i dystansowniki przez oczyszczenie ich mieszaniną KOH,•metanol (odcz. 5), przemycie ogrzanym detergentem i dokładnie wypłukanie. Następnie przetrzeć płyty etanolem (odcz. 6) i pozostawić do wyschnięcia.

4.    Złożyć płyty z dystansownikami i okleić je taśmą. Dla uniknięcia przeciek* poliakrylamidu należy płyty uszczelnić, np. przez wprowadzenie do miejsc połączeń taśma/płyta niewielkiej ilości 1% agarozy.

5.    Na podstawie rozmiarów płyt i dystansowników oraz tab. 10.10 obliczyć objętości odczynników przygotowanych w etapie 1. i 2. do sporządzenia żelu o wymaganej gęstości.

Tabela 10.10. Objętości odczynników do sporządzania żeli poliakrylamidowych o wymaganym stężeniu

Odczynnik	Objętość odczynników (ml) do .sporządzenia żelu o zadanym stężeniu (%)
	3,5%	5,0%	8,0%	12,0%	20%
30% roztwór akrylamidu	1.6	16.6	26,6	40,0	66,6
Woda	67,7	62,7	52,7	39,3	12,7
5 x TBE (patrz tab. 10.7)	20,0	20,0	20,0	20,0	20,0
10% roztwór nadsiarczanu amonu	0.7	0,7	0,7	0,7	0.7

6.    Dodać 35 pl TEMED (odcz. 8) do każdych 100 ml roztworu akrylamidu. Mieszać stosując mieszadło magnetyczne.

7.    Roztwór akrylamidu wprowadzić do strzykawki o pojemności 50 ml, usunąć powietrze i wprowadzić zawartość strzykawki pomiędzy płyty. Natychmiast po wprowadzeniu akrylamidu włożyć grzebień.

8.    Odczekać 60 min w celu spolimeryzowania żelu; jeżeli w czasie polimeryzacji objętość akrylamidu będzie się zmniejszać, należy ją uzupełniać.

9.    Delikatnie usunąć grzebień i natychmiast przepłukać studzienki wodą; usunąć taśmę oklejającą górną część płyt. Wprowadzić płyty z żelem do zbiornika do elektroforezy. Wypełnić zbiornik buforem 1 xTBE (odcz. 3).

10.    Zmieszać próbki DNA z odpowiednią ilością 6 x buforu obciążającego (odcz. 9) i wprowadzić jc do studzienek w żelu.

11.    Podłączyć elektrody do źródła prądu. Prowadzić elektroforezę do momentu, aż barwnik buforu obciążającego osiągnie wymaganą odległość. Wyłączyć zasilacz i odłączyć od niego elektrody. Odkleić pozostałą część taśmy od płyt, zdjąć górną płytę, usunąć dystansownik.

12.    Zanurzyć żel w roztworze barwiącym (odcz. 10) na 30 45 min. Oglądać żel w świetle UV.

448