img095 2

7)    Stężony roztwór HCI.

8)    Pi'S w Stanic stałym.

Wykonanie: Do 30 g drożdży piekarniczych dodać 20 ml 11₂0 i homogenizował przy kilku tysiącach obr./min przez 2 min (puszkę homogcnizatora umieścić w In dzie). Do homogenatu umieszczonego w lodzie dodać 0,5 objętości 20% roztworu CCI3COOH i mieszać przez 0,5 godz. Osad otrzymany po odwirowaniu (3(KHI obr./min przez 10 min) przemyć 2-krotnie 20 ml 10% roztworu CC1₃COOII mieszając chłodzoną w lodzie zawiesinę przez 10 min, a następnie odwirować.

Do połączonych supernatantów dodać objętości 6% roztworu CdCI, i pil roztworu doprowadzić ostrożnie do wartości 5,0 za pomocą 10 M roztworu NaOll a następnie do 6,5, używając 5% roztworu NaHC0₃. Wytrącony kompleks glutatio nu z kadmem zostawać na godzinę w łodzie, następnie odwirować. Osad przenieść do probówek wirówkowych na 10 ml, po czym przemyć 2-krotnie oziębioną wodą Osad rozpuścić w możliwie najmniejszej ilości 1 M roztworu H₂S0₄, potem dodać 3 ml 0,25 M roztworu H₂S0₄ i roztwór przesączyć lub odwirować. Do przesączu ogrzanego w łaźni wodnej do 40°C dodać kroplami, delikatnie wstrząsając, zawiesinę 2,5 mg Cu₂0 w H₂0. Wytrącony osad merkaptydu miedziowego pozostawi* w lodówce na kilka godzin, następnie odwirować i przemyć 2-krotnie za ponuną 5 ml 0,25 M roztworu H₂S0₄, 3-krotnie zimną wodą i 3-krotnie metanolem. Osad wysuszyć do stałej masy w próżni w' temp. 80°C.

W celu wyizolowania wolnego tripeptydu można rozłożyć merkaptyd miedziowy glutationu w wodnej zawiesinie za pomocą H₂S (z aparatu Kippa) i ciecz, po usunięciu Cu₂S, zliofilizować. W chromatografii cienkowarstwowej merkaptyd nue* dziowy jest wygodną pochodną.

b)    Hydroliza kwasowa glutationu

Odczynniki:

1)    2 M roztwór HCI.

2)    P₂0₅ w stanic stałym (uwaga! związek żrący i bardzo higroskopijny).

3)    KOH w stanic stałym.

Wykonanie: Od ważkę 3 mg otrzymanego preparatu merkaptydu miedziowego glut a tionu przenieść do wąskiej grubościennej probówki i dodać 0,3 ml 2 M roztworu HCI. Probówkę zatopić i umieścić w cieplarce (w temp. 105°C przez 24 godz.). Po oziębieniu otworzyć ostrożnie probówkę i hydrolizat przenieść ilościowo do parów niczki szklanej dodając ok. 2 ml H₂0. Parowniczkę umieścić w eksykatorzo próżniowym nad P₂O_s i KOH i odparowywać hydrolizat aż do uzyskania pH oho jętnego. Wtedy próbkę odparować do sucha, a następnie dodać 0,5 ml H₂0. l ak przygotowany hydrolizat można nanosić na chromatogramy. Równolegle w iden tyczny sposób przeprowadzić hydrolizę 3 mg preparatu wzorcowego glutationu.

c)    Rozdział chromatograficzny

Odczynniki:

1)    Żel krzemionkowy (Kiesclgel G lub Silica Gcl G).

2)    n-bulunol.

3)    CH ,COOH lodowaty.

4)    0,02 M wodne roztwory wzorcowe cysteiny, glicyny, kwasu glutaminowego

5)    Odczynnik ninhydrynowy. Do 95 ml 0.5% roztworu nłnltydryny w acetonie dodać I ml lodowatego CHjCOOH i 4 nil ll₂0. Odczynnik przygotować he/pośrednio przed użyciem.

Wykonanie:

1.    Przygotowanie chromatogramu. Płytkę należy bardzo dokładnie wymyć mieszani-ii.i chromową, a następnie wodą zwykłą i destylowaną i wysuszyć. Żel krzemionkowy (ok. 3 g na 1 płytkę) zmieszać z 2 objętościami H₂0; po uzyskaniu jednorodnej półpłynnej pasty wlać do powlekacza i przeciągnąć przyrząd jednym ruchem przez przygotowany rząd płytek. Wszystkie czynności wykonać szybko, gdyż żel prędko krzepnie, ze względu na zawartość gipsu. Płytki powleczone zawiesiną pozostawić do momentu, gdy powierzchnia żelu zmatowieje (ok. 15 min); nie należy ich suszyć strumieniem powietrza, gdyż. powoduje to uszkodzenia i pofałdowania powierzchni. Bezpośrednio przed użyciem płytki należy zaktywować, ogrzewając je \\ cicplarce (w temp. 110°C przez 15 min). W tym czasie przygotować rozpuszczalnik (patrz niżej) i jego część zużyć do wysyccnia komory.

2.    Nanoszenie substancji. Linię startu zaznaczyć w odległości 2 cm od brzegu wzdłuż krótszego boku płytki, za pomocą ostro zatemperowanego ołówka lub rylca. Na niej w równych odległościach nanieść po 5 pl: 0,02 M roztworów cystyny, glicyny, kwasu glutaminowego, a ponadto hydrolizatu wzorcowego preparatu glutationu i hydrolizatu merkaptydu miedziowego glutationu. Plamy można suszyć ostrożnie zimnym strumieniem powietrza. Na górnym brzegu płytki, przeciwległym do linii startu, należy oznaczyć plamy numerami lub napisać, co zawierają.

3.    Rozwinięcie chromatogramu. Chromatogram jest rozwijany w układzie rozpuszczalników: n-butanol/CH₃COOH/H₂0 (60:20:20). Płytkę zanurzyć w rozpuszczalniku tak, aby dolna krawędź była w momencie zanurzenia możliwie dokładnie równoległa do powierzchni cieczy w komorze. Zwrócić uwagę, aby krawędzie boczne nie dotykały ścian komory, gdyż powoduje to nierównomierne wznoszenie się rozpuszczalnika (na bokach płytki wędruje on wtedy szybciej). Na ogół odległość 10 cm uważa się za wystarczającą do rozwinięcia chromatogramu. Po wzniesieniu się rozpuszczalnika na tę wysokość, płytkę wyjąć i wysuszyć w pozycji poziomej w temperaturze ok. 60°C. Pamiętać o zaznaczeniu czoła rozpuszczalnika.

4.    Wywołanie chromatogramu. Płytkę po wysuszeniu ustawić pionowo i spryskać roztworem ninhydryny z rozpylacza. Spryskiwać ostrożnie i z odpowiedniej odległości, tak aby krople spadające na płytkę nie uszkadzały ani nie zmywały warstwy. Aminokwasy ujawniają się jako różowe plamy na białym tle. Na podstawie współczynników R_f zidentyfikować położenie poszczególnych aminokwasów.

Ćwiczenie 4.13. Chromatografia cienkowarstwowa niektórych jednocukrów

Odczynniki:

1)    Żel krzemionkowy (Kicsclgel G lub Silica Gcl G).

2)    n-butanol.

3)    Aceton.

4)    0,5% wodne roztwory glukozy i kwasu glukuronowego.

5)    0,l M roztwór AgNO_v

135