07

Wykonanie: 700-miligramowe odważki DFAE-celulozy zawiesić w 1 M roztworze NaOH na 2 godz., następnie przemyć wodą do pH 7,0 i zawiesić w 0,01 M buforze fosforanowym.

Do rozdziału stosować naczynka plastikowe z dziurkowanym dnem, które należy za pomocą gumowych pierścieni umocować w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml. Na dno naczynka włożyć 2 krążki bibuły Whatman i osadzić adsorbent w ilości 700 mg. Złoże należy przemyć 0,01 M buforem fosforanowym o pH 7,0 do zaniku absorbancji w A = 260 nm. Następnie na złoże nanieść 10 ml roztworu DNA w 0,014 M roztworze NaCl w ilości 20 jednostek optycznych (ok. 1 mg). Zbierać po 5 frakcji o objętości 10 ml każdego z eluatów. Po nalaniu do naczynka 10 ml cluentu wirować układ (800 przez 3 min). Odwirowane frakcje przelać do probówek. Absorbancję odczytywać spcktrofotometrycznie w paśmie 260 nm.

10.2.6. Oscylopolarograficzne i pulsopolarograficzne badanie preparatów DNA

Polarografia jest metodą elektrochemiczną, polegającą na badaniu zmian natężenia prądu płynącego przez badany roztwór. Posługuje się ona kroplową elektrodą rtęciową, do której przykłada się napięcie wzrastające w sposób ciągły. Krzywa zależności natężenia prądu od napięcia pozwala zarówno jakościowo, jak i ilościowo oznaczyć substancje zawarte w roztworze. Naczynko elektrolityczne, w którym znajduje się badany ro/twór, zawiera elektrodę porównawczą. Jest nią zwykle warstwa rtęci znajdująca się na dnie naczynka. Jeżeli roztwór badany zawiera substancje, które uległy elektrolizie, tzw. depolaryzatory, to przy określonym napięciu następuje wzrost natężenia prądu. Wielkość tego napięcia charakteryzuje dcpolaryzator pod względem jakościowym, zc wzrostu zaś natężenia prądu wyznacza się stężenie depolaryzatora w roztworze.

Oscylopolarografia (polarografia oscylograficzna) została wprowadzona do badań przez Heyrowskiego w 1941 r. W metodzie tej kroplowa elektroda rtęciowa jest polaryzowana prądem zmiennym o częstotliwości 50 Hz, w związku z czym jedna krzywa polarograficzna rysuje się w ciągu 1,50 s. Przebieg procesu elektrodowego związanego z polaryzacją kroplowej elektrody jest rejestrowany na ekranie oscyloskopu, jako funkcja dE/dt = /(£). Depolaryzatory tworzą spadki potencjału (wgię-cia) na krzywej charakterystyczne dla danej substancji (przykład krzywej dla DNA: rys. 10.7). Górna część krzywej obrazuje przebieg polaryzacji katodowej w zakresie potencjału od 0 do —2 V (zgodnie ze składem danego elektrolitu), obniżająca się cześć krzywej — przebieg polaryzacji anodowej od -2 V do 0. Lewy krańcowy punkt odpowiada rozkładowi rtęci, prawy — osadzaniu kationów elektrolitu. W przypadku obecności w roztworze depolaryzatora tworzą się na krzywej dE/di = /(£) wgięcia (indentation). Na przykład w obecności jonów kadmu w części katodowej pojawia się wgięcie przy potencjale, w którym tworzy się amalgamat kadmu. Wgięcie w anodowej części krzywej odpowiada wówczas rozpuszczeniu się tego amalgamatu i regeneracji jonów kadmu. Porównanie położenia wgięć umożliwia rozstrzygnięcie, czy proces elektrodowy jest odwracalny.

Jeżeli wgięcia katodowe i anodowe mają ten sam potencjał, proces jest odwracalny,

407