07

na wyeluowaniu rozdzielonych związków z bibuły i spektrofotometrycznym pomiarze absorbancji w odpowiednich maksimach dla poszczególnych substancji.

Mniej powszechna od chromatografii bibułowej jest metoda kolumnowa analizy składu hydrolizatów kwasów nukleinowych z użyciem żywic jonowymienych. Do najczęściej stosowanych żywic jonowymiennych należą: anionit Dowex-l i kationit Dowex-50. Poszczególne nuklcotydy (najczęściej bowiem rozdziela się te produkty hydrolizy kwasów nukleinowych) eluuje się z kolumny roztworami rozcieńczonych kwasów (HC1, HCOOH).

Zaletą chromatografii cienkowarstwowej w zastosowaniu do zasad purynowych i pirymidynowych oraz ich pochodnych jest krótki czas rozdziału (kilkadziesiąt minut), a także możliwość analizowania bardzo małych, mikrogramowych ilości substancji. Dobry rozdział nukleotydów uzyskiwano na ECTEOLA-celulozie stosując jak rozwijacz 0,06 M roztwór HC1. Opracowano także metodę dwuwymiarowego rozdziału rybonukleotydów na DEAE-celulozie z użyciem jako rozwijaczy

0. 005.M roztworu HC1 w jednym kierunku i 0,035 M roztworu HC1 w drugim kierunku. Dobry rozdział produktów' hydrolizy kwasów' nukleinow'ych można także otrzymać stosując technikę elektroforetyczną.

Ćwiczenie 10.30. Oznaczanie składu nukleotydowcgo RN A metodą jednowymiarowej chromatografii bibułowej (B.G. Lane 1963: Biochim. Biophys. Acta, 72:l 10—112)

Zasada: Metoda jest oparta na chromatograficznym rozdziale nukleotydów z zasadowego hydrolizatu RNA, w'yeluow'aniu ich z chromatogramu i ilościowym oznaczeniu metodą spektrofotometryczną.

Materiał: Preparat całkowitego RNA.

Odczynniki:

1)    Roztwory: 0.01 M HO, 0,5 M KOH, 40% KOH. 3% HCI0₄, 60% HC10₄.

2)    Roztwór (NH₄)₂S0₄ (l obj. nasyconego roztworu (NH₄)₃S0₄ + 9 obj. H₂0).

3)    75% roztwór etanolu.

4)    Bibuła Whatman nr I i filtracyjna.

Wykonanie:

1.    Hydroliza zasadowa RNA. Próbkę RNA (ok. 3 mg) zhydrolizować w 0,5 M roztworze KOH (0,5 ml w temp. 37°C przez I8 godz.). Ochłodzony w łaźni lodowej hydrolizat zobojętnić następnie 60% roztworem 1IC10₄ oraz dodać 60% roztwór HC10₄ do końcowego stężenia około 3% w' celu wytrącenia ewentualnych zanieczyszczeń polideoksyrybonukleotydowych. Roztwór odwirować. Powitały osad. zawierający KC10₄ i ewentualny DNA, przemyć 2-krotnie 3% roztworem HC10₄ i ponownie odwirować. Połączone i umieszczone w^r lodzie supernatanty zobojętnić 40% roztworem KOH. Wytrącony KC10₄ odwirować. Supernatant zawierający wolne 2'- i 3'-mononukleotydy nanieść na bibułę.

2.    Przygotowanie chromatogramu. Pasek bibuły Whatman nr l o szerokości I5 cm i długości 45 cm przeciągnąć przez roztwór (NH₄)S0₄ i wysuszyć w temperaturze pokojowej. Linię startu wykreślić w odległości 7 cm od węższego boku paska. Hydrolizat RNA (50 pi) nakraplać małymi porcjami, osuszając bibułę strumieniem ciepłego powietrza.

417