0
7

jednak na tyle mały, aby naruszyć integralność błon komórkowych. Odległość między tłokiem i ściankami naczynia można w przybliżeniu określić na 0,2 mm. Dla I serca, nerki i wątroby, w przypadku tkanki mrożonej, wystarcza 2-5 pasaży, I natomiast dla tkanki świeżej — 15-30.

3)    Po wyizolowaniu mitochondriów procedurę można przerwać na czas do 1 tygodnia, ale należy wówczas zamrozić preparat w temp. — 70°C, najlepsze rezultaty

I otrzymuje się jednak zachowując ciągłość postępowania.

4)    Roztwór mtDNA powinno się przechowywać w temp. — 20°C.

5)    Wydajność metody wynosi około 1 pg mtDNA z 1 g tkanki.

Ćwiczenie 10.7. Izolowanie DNA z jądrzastych erytrocytów (J.F. Medrano i wsp. I 1990: Biotechniąues, 8:43)

Takie kręgowce jak ryby, płazy, gady i ptaki charakteryzują się występowaniem I erytrocytów jądrzastych (Andrew 1965). Ryby mają średnio po 500000-2600000 I erytrocytów w 1 mm³, a np. erytrocyty pstrąga zawierają 5,6 pg DNA na jądro I (Mirsky i Ris 1949). Wynika stąd, że można otrzymać znaczącą ilość DNA ze I stosunkowo niewielkiej ilości krwi. Podobnie kurczęta mają ok. 3000000 eryt-I rocytów w 1 mm³, zawierających 2,34 pg DNA na jądro.

I Zasada: Metoda ta opiera się na odbiałczaniu z użyciem nasyconego roztworu NaCl I w celu odwodnienia i wytrącenia białek komórkowych (ćw. 10.3).

J Materiał: Krew ryby.

I Odczynniki:

1)    EDTA jako antykoagulant.

2)    Bufor do lizy: 10 mM Tris - 400 mM NaCl - 2 mM EDTA (pH 8,2).

3)    1% roztwór SDS w 2 mM EDTA (pH 8,2).

4)    Roztwór proteinazy K o stężeniu 2 mg/ml.

5)    6 M roztwór NaCl.

6)    96% roztwór etanolu.

7)    70% roztwór etanolu.

8)    Bufor TE o pH 7,6: 10 mM Tris/HCl - 0,2 mM EDTA.

Wykonanie:

1.    Krew z żyły ogonowej pstrąga lub karpia pobrać na antykoagulant (odcz. 1) do probówki o pojemności 5 ml znajdującej się w lodzie. Odwirować (1300 xg w temp. 4°C przez 30 min).

2.    10-100 pl upakowanych erytrocytów z osadu zawiesić w 3 ml buforu do lizy (odcz. 2) w probówce o pojemności 15 ml. Dodać 0,2 ml SDS (odcz. 3) i 0,5 ml proteinazy K (odcz. 3). Inkubować w temp. 50°C przez 2 godz., łagodnie wytrząsając dla strawienia białek jądrowych i komórkowych.

3.    Strawione białka wytrącić przez dodanie 1 ml 6 M roztworu NaCl (odcz. 5) i energiczne wytrząsanie przez 15 s.

4.    Odwirować (1300x0 w temp. 4°C przez 15 min). Supernatant zawierający DNA przenieść do innej probówki.

5.    Przeprowadzić 2-krotnie wysalanie białek według procedury opisanej w punktach 3. i 4. Po ostatniej ekstrakcji supernatant powinien być przejrzysty.

377