07 2

1) Zdolność rozdzielcza żeli poliakrylamidowych jest tak duża, że mogą odseparować cząsteczki DNA różniące się o 0,2%, np. o 1 pz przy długości 500 pz. 2) Mogą przyjąć znacznie większe ilości DNA niż żele agarozowe (do studzienki o wymiarach 1 cmxl mm można wprowadzić — bez straty rozdzielczości do 10 pg DNA). 3) DNA odzyskany z żelu poliakrylamidowego charakteryzuje się dużą czystością i może być stosowany w większości badań z zakresu biologii molekularnej, bez dodatkowego oczyszczania.

Powszechnie stosuje się dwa typy żeli poliakrylamidowych: denaturujące i niede-naiurujące, zależnie od tego, czy analizuje się jedno- czy dwuniciowy kwas nukleinowy.

Ćwiczenie 10.41. Elektroforeza DNA w żelu poliakrylamidowym (J. Sambrook i wsp. 1989: Molecular cloning. A laboratory manuał. Book 1. Cold Spring Harbor Uboratory Press, Cold Spring Harbor, 6.39-6.44)

Większość dostępnych w handlu aparatów do elektroforezy pionowej w żelu poliakrylamidowym zawiera płyty o wymiarach 20 x 40 cm, jednak możliwe jest przeprowadzanie elektroforezy na mniejszych lub większych płytach. Grubość żelu jest zdeterminowana przez grubość dystansowników i wynosi typowo 0,5 -2 mm. Należy pamiętać, że im grubszy żel, tym bardziej będzie się nagrzewał podczas elektroforezy; przegrzanie żelu może prowadzić do powstawania tzw. efektu uśmiechu i innych niepożądanych zjawisk, wobec czego nie należy stosować żeli grubszych niż to konieczne. Grubych żeli używa się do przeprowadzania elektroforezy i. dużą ilością DNA (> 1 pg na ścieżkę).

Zasada: Podobnie jak w żelach agarozowych (ćw. 10.37), w żelach poliakrylamidowych można dokonywać rozdziału cząsteczek DNA względem ich masy — im dłuższa cząsteczka, tym mniejsza jej ruchliwość elektroforetyczna. Należy brać pod uwagę również zależność ruchliwości elcktroforetyczncj cząsteczek DNA od ich konformacji oraz pamiętać o tym, że obecność bromku ctydyny podczas elektroforezy zmniejsza szybkość migracji i może wpływać na konformację DNA. Rozdzielczość żeli poliakrylamidowych jest większa niż żeli agarozowych, a uzyskiwany w nich zakres efektywnego rozdziału wynosi typowo 6-2000 pz.

Materiał: DNA Odczynniki:

1)    Akrylamid.

2)    )V.iV'-mctylcnofc/.vak rylamid.

3)    i x bufor TBE (tab. 10.8).

4)    (NH₄)₂S₂0₈.

5| Mieszanina I g KOH i 20 ml metanolu.

6)    96% roztwór etanolu.

7)    5 x bufor TBE (tab. 10.8).

8)    TEMED (jV,iV,iV',jV‘-tetramctyloctylcnodiamina).

9)    6 x bufor obciążający typu 1 lub II (tab. 10.8).

10)    Roztwór barwiący: 0,5 gg bromku etydyny w buforze TBE.

11)    Agaro/a do uszczelnienia płyt.

Aparatura: Aparat do elektroforezy, lampa lub transiluminator UV.

447