06

Wykonanie:

1.    Otrzymanie limfocytów. Warstwę leukocytarną wyizolować metodą sedymentacji, dodając do krwi — w celu przyspieszenia tego procesu — równą objętość 1,2% roztworu alkoholu poliwinylowego. Sedymentację prowadzić w temperaturze pokojowej przez 1 godz. Po upływie tego czasu zebrać warstwę górną, bogatą w' leukocyty i przenieść ją do rozdzielaczy (500 ml) luźno wypełnionych gazą stylonową, uprzednio zwilżoną roztworem Hanksa. Rozdzielacze wstawić do cieplarki (w temp. 37^ prze? 40 min). Po inkubacji oddzielić warstwę zawierającą limfocyty, a następnie zagęścić ją przez wirowanie (1000 przez 10 min). Osad limfocytów zawiesić w 0,25 M roztworze sacharozy z dodatkiem CaCl₂ i cytrynianu sodu. Do zawiesiny dodać 5% roztworu Tritonu X-100do końcowego stężenia 0,5%. Inkubować zawiesinę komórek w łaźni lodowej przez 5 min. Uwolnione jądra komórkowe odwirować (800 xg przez 15 min), powtórnie zawiesić w 0,25 M roztworze sacharozy (z CaCI₂ i cytrynianem sodu) i odwirować jak poprzednio. Osad jąder zalać roztworem NNE, delikatnie mieszać przez ok. 30 min i odstawić na noc do chłodni.

2.    Oznaczanie lepkości jednoniciowych preparatów DNA. Lepkość DNA wyznaczyć, jak opisano w ćw. 10.24. Do wyliczenia masy cząsteczkowej DNA w zasadowych lizatach jąder komórkowych przyjąć następujące współczynniki: K = 1,435-10 ~⁴, a = 0,723.

10.2.5. Badanie niejednorodności preparatów DNA

Pomiar lepkości pozwala wyznaczyć średnią masę cząsteczkową, nie mówi natomiast nic o jej rozrzucie. Do badania niejednorodności preparatów DNA stosuje się często metody chromatograficzne, m.in. rozdział na DEAE-celulozie. Chromatografia na celulozie anionitowej pozwala rozdzielić preparat zawierający nici DNA o różnej długości na frakcje z DNA o określonym stopniu spolimeryzowania.

Ćwiczenie 10.26. Chromatografia wirówkowa preparatu DNA na DEAE-celulozie

(C. Davila i wsp. 1965: J. Chromatogr., 19:382-403)

Zasada: Cząsteczka DNA o mniejszej masie wiąże się z amonitowym wymieniaczem słabiej niż cząsteczka w'yżej spolimeryzowana. Przyczyną występowania powinowactwa jonowego o różnej sile wiązania jest zmienna ilość grup fosforowych związana z różną długością łańęucha DNA. Powinowactwo DNA do wymieniacza zależy także od Il-rzę-dowej struktury wielkocząsteczck. Wraz ze wzrastającą siłą jonową eluentów wymywają się wyżej spolimeryzowane frakcje DNA, silniej wiązane przez złoże. Do wymycia najwyżej spolimeryzowanych frakcji używa się eluentów o większych wartościach pH.

Materiał: Roztwór DNA o stężeniu 75 100 pg/ml w 0,014 M roztworze NaCl.

Odczynniki:

1)    DEAE-celuloza.

2)    0,01 M bufor fosforanowy (pH 7,0).

3)    0,14 M, 0,5 M i 1 .VI roztwory NaCl w 0,01 M buforze fosforanowym (pH 7.0).

4)    0,2 VI roztwór NH_X w 2 VI roztworze NaCl.

5)    0,5 M roztwór NaOH.

406