04

kości otrzymane wartości [i/] mogą być odpowiednio zwiększone lub zmniejszone. Aby otrzymać absolutne wartości używając wiskozymetrów kapilarnych, trzeba dokonać korekty wyników pomiarów.

Najlepsze rezultaty daje skalowanie wiskozymetru kapilarnego według wiskozymetru rotacyjnego Zimma, tzn. porównanie wartości [»j] otrzymanych w obu typach wiskozymetrów dla roztworów DNA o różnym stopniu spolimeryzowania. Koniecznym warunkiem jest zawsze jednakowe, możliwłe małe stężenie roztworu DNA i jednakowa objętość badanej próbki.

Ćwiczenie 10.24. Wyznaczanie lepkości natywnego preparatu DNA w 3-kulkowym niskogradientowym zmodyfikowanym wiskozymetrze Eignera

Zasada: Oznaczenie lepkości istotnej dość często stosuje się do wyznaczenia mas cząsteczkowych kwasów nukleinowych. Badanie roztworów kwasów nukleinowych wymaga szczególnej uwagi, przede wszystkim z powodu bardzo dużej masy cząsteczkowej DNA. W roztworze tak wielkich cząsteczek siły oddziaływań międzycząs-teczkowych przyjmują duże wartości. Poza tym cząsteczki kwasów nukleinowych łatwo poddają się deformacjom, nawet przy stosunkowo małych gradientach prędkości strumienia. Należy więc stosować małe stężenia preparatu i granicznie małe gradienty prędkości strumienia. Cząsteczka natywnego DNA o konformacji kłębka, jak wskazują dane rozproszenia światła, ma rozmiary większe niż zwyczajny kłębek gaussowski, utworzony z giętkiego łańcucha polimeru o tej samej długości. Jest to wynikiem względnej sztywmości podwójnego heliksu DNA, nie pozwalającej na ostre i częste załamania. Dostatecznie długie odcinki heliksu DNA charakteryzuje jednak pewna giętkość, która pozwala cząsteczce DNA przyjmować kształt kłębka. Wielkocząsteczki łańcuchowe o takich właściwościach nazywa się półsztywnymi. Dla tego typu włelkocząsteczek w praktyce jest szeroko stosowana doświadczalna zależność, jednoznacznie wiążąca lepkość istotną kłębka gaussowskiego z jego masą cząsteczkowy:

[ff] mK-M*

W równaniu na lepkość istotną dla takich cząsteczek wykładnik potęgi a powinien przybierać wartość pośrednią między a = 0,5 (giętkie cząsteczki łańcuchowe) i a = l,8 (sztywne cząsteczki w' kształcie pałeczek). Wartość potęgi a dla DNA o różnych m.cz. (0,3-10⁶-130 10⁶ Da) rzeczywiście leży w tym przedziale. Dla małych wartości m.cz. (0,3-10⁶-2-10⁶) kształt cząsteczki DNA jest zbliżony do pałeczki (a = 1,32, K = 1,05-10⁷). Cząsteczka DNA o masie cząsteczkowej większej od 2* 10⁶ Da przybiera kształt kłębka gaussowskiego (a = 0,7; K — 6,9-10 ~⁴).

Materiał: 0,002% roztwór DNA w roztworze SSC.

Odczynniki:

1) Roztwór SSC: 0,14 M roztwór NaCI w 0,014 M roztworze cytrynianu sodu.

Wykonanie: Pomiar lepkości przeprowadzić w' temp. 25°C. Do dokładnie w^fysuszo-nego wiskozymetru wprowadzić 10 ml roztworu SSC. Zmierzyć czas wypływu dla

404