0
6

4)    Roztwór do lizy zasadowej — roztwór octanu potasowego 3 M względem potasu i 5 M względem octanu. Do 60 ml 5 M roztworu CH₃COOK dodać 11,5 ml lodowatego CH₃OOH i 28,5 ml H₂0.

5)    Mieszanina: fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (obj. 25:24:1).

6)    Etanol absolutny.

7)    70% roztwór etanolu.

8)    Roztwór RNazy o stężeniu 20 pg/ml w buforze TE o pH 8,0: 10 mM Tris/HCl - 1 mM EDTA. Ważniejszy przyrząd: Homogenizator tłokowy.

Wykonanie:

1.    50 mg rozdrobnionej tkanki homogenizować w buforze do homogenizacji (odcz. 1). Przenieść homogenat do probówki o pojemności 1,5 ml i wirować (1000 xg w temp. 4°C przez 1 min) w celu osadzenia jąder i fragmentów komórkowych.

2.    Supernatant odwirować (12000 xg w temp. 4°C przez 10 min), by osadzić mitochondria.

3.    Usunąć supernatant i zawiesić osad zawierający mitochondria w buforze 2; całkowita objętość roztworu powinna wynosić 50 gl. Dodać 100 gl NaOH w SDS (odcz. 3). Wytrząsać krótko na wytrząsarce typu Vortex.

4.    Inkubować w lodzie przez 5 min. Dodać 75 gl roztworu do lizy alkalicznej (odcz. 3) schłodzonego do temp. ok. 0°C. Łagodnie wytrząsać na urządzeniu typu Vortex. Inkubować w lodzie 5 min.

5.    Odwirować (12000x^1 w temp. 4°C przez 5 min) i zebrać supernatant. Dodać równą objętość mieszaniny fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (odcz. 5), mieszać energicznie przez wytrząsanie na urządzeniu typu Vortex.

6.    Odwirować (12000x0 w temp. pokojowej, 2 min). Przenieść fazę wodną do nowej probówki. Dodać 2 objętości schłodzonego etanolu (odcz. 6), mieszać przez wytrząsanie i pozostawić w temperaturze pokojowej na 15 min.

7.    Odwirować (12000x0 w temp. pokojowej przez 2 min). Osad mtDNA płukać w 1 ml 70% roztworu etanolu (odcz. 7) i suszyć 1-3 min pod obniżonym ciśnieniem.

8.    Osad rozpuścić w buforze TE zawierającym RNazę (odcz. 8).

Uwagi:

1)    Bogate źródło mtDNA stanowią tkanki narządów wewnętrznych, przede wszystkim wątroby, serca, nerek, oraz rybia ikra. Najlepsze rezultaty otrzymuje się używając tkanki świeżej lub zamrożonej nie dłużej niż przez 6 miesięcy. Uzyskiwanie czystego mtDNA z tkanek przechowywanych dłużej jest możliwe, jeżeli znajdują się one temp. — 70°C. Tkanka powinna zostać zamrożona natychmiast po zabiciu zwierzęcia.

2)    Etap homogenizacji ma krytyczne znaczenie dla powodzenia opisanej metody — zbyt intensywna homogenizacja prowadzi do uszkodzenia otoczek jądrowych, co w konsekwencji powoduje zanieczyszczenie preparatu mtDNA jądrowym DNA, podczas gdy homogenizacja niepełna pociąga za sobą małą wydajność procedury. Krytyczne znaczenie w homogenizowaniu ma wielkość przestrzeni między tłokiem i ściankami probówki do homogenizacji. Odstęp ten powinien być wystarczająco duży, aby nie spowodować uszkodzenia mitochondriów,

376