05

3)    Roztwór 0,1 xSSC: 10-krotnic rozcieńczony roztwór SSC (0,14 M NaCI w 0,014 M cytrynianie sodu).

4)    96% roztwór etanolu.

5)    0,075 M roztwór MgCl₂ w 96% etanolu.

Aparatura: Aparat A 3100 firmy Southern Analytical Ltd lub inny o podobnych parametrach.

Wykonanie: Pobrać próbki po 2 ml roztworu DNA i inkubować je w temp. 37°C z różnymi stężeniami DDVP: l_t 3, 4 i 5 pM. Czas inkubacji: 10, 20, 30, 60, 120

1    150 min. Reakcję zatrzymuje się przez wytrącenie DNA z inkubowanych próbek

2    objętościami 96% etanolu z dodatkiem 0,075 M MgCl₂. Osad DNA należy rozpuścić w roztworze 0,1 xSSC i zmierzyć stężenie spektrofotometrycznie (patrz ćw. 10.31). Pomiar pulsopolarograficzny przeprowadza się dla każdej z próbek DNA w 0,3 M roztworze HCOONH₄ o pH 6.9.

Po krótkim czasie inkubacji obserwuje się zmiany wysokości szczytu fali II (por. rys. 10.10), co świadczy o zwiększaniu lokalnych uszkodzeń cząsteczki dwuniciowego DNA oraz przyrost zawartości fragmentów jednoniciowych (podwyższenie fali III). Po dłuższym czasie inkubacji obserwuje się zwiększenie ilości jednoniciowych fragmentów DNA, świadczące o wzroście stopnia denaturacji kwasu, i powstawanie wyłącznie fal III. Szczytu II w tym przypadku nie można zaobsrwować, gdyż został przesłonięty falą III.

Wynik doświadczenia przedstawia się w postaci przyrostu wysokości szczytu II próbki po inkubacji w' stosunku do fali II natywmego DNA. Zwiększenie ilości fragmentów zdenaturowanych ocenia się przez porównanie z wysokością szczytu III DNA w pełni zdenaturow^anego.

10.2.7. Analiza składu nukleotydowego

Oznaczanie składu nukleotydowego kw^fasów nukleinowych ma obecnie drugorzędne znaczenie. Rozwój biologii molekularnej spowodował powstanie now-ej generacji metod badających budowę nukłeotydową DNA i RNA, daleko wykraczających poza proste ustalenie ilościowych proporcji poszczególnych nukleotydów. Wśród tych technik należy wymienić analizę restrykcyjną, metody hybrydyzacyjne z sondami molekularnymi i procedury sekwencjonowania odcinków polinukleotydowych, wykorzystujące terminację enzymatycznej syntezy komplementarnych łańcuchów DNA, kontrolowaną przez pochodne dideoksynukIeotydow'e. Opracowanie metod PCR i RT-PCR pozwala tworzyć in vitro niezliczone kopie fragmentów kwasów nukleinowych o budowńe nukleotydowcj zaplanowanej przez badacza. Można twierdzić, iż w analizach struktury 1-rzędow'cj DNA i RNA kanonem metodycznym jest ustalenie pełnej sekwencji nukleotydowej badanych genów czy produktów ich transkrypcji. Wyrazem tego jest bliska realizacja projektu HUGO (human genome organisation) — zsekwencjonowania całego genomu człowieka.

Oznaczanie składu nukleotydowego kw⁽asów^f nukleinowych poprzedza ich hydroliza do pojedynczych wolnych zasad i nukleotydów. Powstanie tych produktów' rozpadu kwasów' nukleinowych zależy od rodzaju hydrolizy. W przypadku RNA

415