06

5.    Zanurzyć pozostałe kawałki żelu w roztworze bromku etydyny (odcz. 2) na 30-43 minut, sprawdzić w świetle UV, czy nie pozostał jeszcze w nich DNA, jeżeli tak, to należy powtórzyć wykonanie etapów 2. 4.

6.    Ekstrahować eluat mieszaniną fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (odcz. 3), Przenieść fazę wodną do nowej probówki, dodać 0,2 objętości octanu amonu (odcz. 4) i 2 objętości etanolu (odcz. 6) o temp. 4°C, pozostawić w temperatura pokojowej na 20 min. Odzyskać DNA przez odwirowanie (12 000 x ^ w temp. 4 C przez 15 min).

7.    Płukać DNA w 70% roztworze etanolu, suszyć na powietrzu i rozpuszczać w buforze TE (odcz. 1).

Uwagi:

1)    Aby zmniejszyć uszkodzenia radiacyjne, stosować lampę emitującą długofalowe promieniowanie UV.

2)    Wycinając pasmo z żelu unikać wycinania zbędnych fragmentów agarozy, zmniejszając w ten sposób szansę zanieczyszczenia DNA.

3)    Po wycięciu określonych pasm można żel sfotografować w celu archiwizacji położenia odzyskanych fragmentów.

4)    Zamykając worek dializacyjny należy unikać wprowadzania do jego wnętrza pęcherzyków powietrza.

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym. Monomery akrylamidu mogą uczestniczyć w reakcji polimeryzacji w obecności wolnych rodników', które są dostarczane przez (NH^SjOg i stabilizowane przez TEMED. Jeżeli do reakcji tej zostanie wdączony zwuązek dwufunkcyjny iV,A''-metylenoójsakrylamid, to łańcuchy spolimeryzowanego akrylamidu zostaną połączone krzyżowo, tworząc żel poliakrylamidow'y, szeroko stosowany w clektroforetycznej analizie kwasów nukleinowych.

Elektroforezę w żelach poliakrylamidowych zazwyczaj przeprowadzana się w aparatach ustawionych pionowo, więc migracja cząsteczek kw^fasów nukleinowych jest zgodna z kierunkiem siły ciążenia. Żele poliakrylamidowe stosuje się do rozdziału fragmentów kwasów' nukleinowych o mniejszej długości niż w' żelach agarozowych (tab. 10.9).

Wprawdzie żele poliakrylamidowe są znacznie trudniejsze do przygotowania i manipulacji od żeli agarozowych, mają jednak nad nimi niewątpliwie przewagę:

Tabela 1U.9. Rozdzielczość żeli poliakrylamidowych o różnych stężeniach

Stężenie poliakrylamidu %	Zakres długości rozdzielanego liniowego DNA (pz)
3,5	1000 2000
5,0	80^ 500
8,0	60 400
12.0	40 200
15,0	25-150
20,0	6-100

446