06

Spektrofotometria fluorescencyjna. Spektrofotometryczne analizy pochłaniania przez kwasy nukleinowe promieniowania w zakresie UV w ostatnich latach rozszerzono o techniki spektrofluorymetrycznc, oparte na zjawisku fluorescencji. Fluorescencja — to proces wysyłania określonego promieniowania (luminescencja) przez pewne substancje (fluorochromy), spowodowany uprzednim pochłonięciem światła, jeśli od momentu absorpcji pobudzającego kwantu energii do wyemitowania własnego promieniowania nie upłynęło więcej niż 10 ~⁸ sekundy. Zwykle promieniowanie wysyłane w czasie fluorescencji ma mniejszą energię niż promieniowanie pochłonięte. Wynika to z faktu, że cząsteczki fluorochromu w stanie pobudzonym istnieją na tyle długo, że przed emisją nadmiaru energii wewnętrznej zdążą zderzyć się z innymi cząsteczkami i przekazać im część swojej energii. Zjawisko fluorescencji charakteryzują liczne parametry, z których należy szczególnie wymienić wydajność kwantową (stosunek ilości kwantów wyemitowanych do ilości kwantów pochłoniętych) oraz widma wzbudzenia (ekscytacji) i luminescencji (promieniowania emitowanego). Fluorescencja stała się podstawą techniki analitycznej, jaką jest spektrofluorymetria. Wykorzystuje się w niej fakt, że natężenie luminescencji jest — w pewnych granicach — wprost proporcjonalne do ilości (stężenia) związku fluoryzującc-go. W porównaniu z absorpcjomctrią fluorymctria jest metodą ok. 1000 razy czulszą. Właściwość fluorescencji -mogą wykazywać tylko te związki, które pochłaniają światło. Kwasy nukleinowe, chociaż spełniają powyższy warunek, nie są związkami fluoryzującymi (fluorochromami). Z powodzeniem można jednak do nich stosować metody pośredniego oznaczania fluorymetrycznego. Podobnie jak w kolorymetrii, pośrednio oznaczany związek poddaje się reakcji z odpowiednim odczynnikiem, w wyniku której powstaje produkt zdolny do fluorescencji. Odczynniki używane we fluorymetrii same są najczęściej fluorochromami, stąd dodatkowym wymaganiem w metodyce pośredniego oznaczania fluorymetrycznego jest, aby nadmiar odczynnika w warunkach prowadzonej reakcji nie wpływał na intensywność luminescencji powstałego produktu. Osiąga się to wykorzystując istotne różnice między widmami wzbudzenia i luminescencji wolnego fluorochromu oraz produktu: fluorochrom-oznaczany związek. Dokonuje się zatem odpowiedniego doboru długości fali promieniowania wzbudzającego i długości fali mierzonej luminescencji.

Kwasy nukleinowe wykazują zdolność reagowania ze związkami fluoryzującymi.

Wykorzystuje się to w bardzo wielu różnych technikach analitycznych, jak badania cyto- i histologiczne, wybarwianie żeli elektroforetycznych, ilościowe testy spektro-fluorymetryczne śladowych stężeń wyizolowanych kwasów nukleinowych oraz oznaczenia ich ilości w poszczególnych komórkach z użyciem najnowocześniejszej techniki ostatnich lat, którą stanowi cytofluorymetria przepływowa. We wszystkich tych metodach stosuje się oddziaływanie kwasów nukleinowych ze szczególnym typem fluoro-chrompw, jakimi są związki interkalujące. Należą do nich m.in. bromek etydyny, oranż akrydynowy, jodek propidyny, pochodne antrachinonów i pironina Y. Związki te, chociaż znacznie różnią się budową chemiczną, wykazują wspólną cechę budowy przestrzennej. Ich cząsteczki, w całości lub w określonych fragmentach, mają płaską, hydrofobową strukturę, która umożliwia im „wsuwanie się” (interkalację) pomiędzy równolegle ułożone płaszczyzny komplementarnych zasad azotowych kolejnych nuk-leotydów w dwułańcuchowej strukturze DNA i we fragmentach cząsteczek RNA. Nie do końca wytłumaczone jest natomiast oddziaływanie tych barwników z jednołańcu-chowymi cząsteczkami kwasów nukleinowych, gdzie kolejne zasady azotowe nie tworzą stabilnych „szczelin” do interkalacji. Powinowactwo omawianych związków do kwasów nukleinowych jest tak silne, że w określonych warunkach reakcyjnych można je traktować jako swoiste i wykorzystywać do wybiórczego oznaczania kwasów nukleinowych w mieszaninie innych związków, a nawet do selektywnego ich wybarwiania fluorescencyjnego w obrębie całej komórki. Z przyczyn konformacyjnych DNA reaguje z interkalującymi fluorochromami silniej niż RNA, ale odpowiedni dobór warunków reakcji oraz parametrów pomiarów fluorescencji umożliwia jednoczesne

396