06

4.    Eluować poli(A)⁺RNA z celulozy oligo(dT) 2-3 objętościami buforu do elucji (odcz. 5) i zbierać frakcje o objętości równej 73^— 72 pojemności kolumny.

5.    Dokonać pomiaru absorbancji frakcji przy A = 260 nm. Połączyć frakcje zawierające RN A.

6.    Ogrzewać RNA w temp. 65°C przez 3 min, a następnie szybko ochłodzić do temp. pokojowej.

7.    Doprowadzić stężenie NaCl w roztworze RNA do 0,5 M i przeprowadzić drugi etap elucji według etapów 2.-5.

8.    Do poli(A)⁺RNA dodać CH₃COONa (odcz. 6) do stężenia końcowego 0,3 M i dobrze wymieszać. Wprowadzić 2,5 objętości schłodzonego do temp. 0°C etanolu (odcz. 7) i inkubować w lodzie co najmniej przez 30 min.

9.    Odzyskać RNA przez wirowanie (10000x0 w temp. 4°C przez 15 min). Odrzucić supernatant i przemyć osad RNA 70% roztworem etanolu. Suszyć osad na powietrzu.

10.    Rozpuścić osad RNA w małej ilości H_zO w probówkach polipropylenowych i przechowywać w temp. — 70°C.

Uwagi:

1)    Jako kolumny można używać pipety pasterowskiej zamkniętej watą szklaną.

2)    Ogrzewanie roztworu RNA (etap 2.) powoduje rozpad struktur drugorzędowych mogących obejmować odcinek poliadenylowy.

3)    Kuwety do pomiaru absorbancji (etap 5.) powinno się bezpośrednio przed użyciem moczyć w mieszaninie stężonego HC1 z metanolem (1:1) i płukać w sterylnej wodzie.

4)    Osad RNA po wirowaniu (etap 9.) jest często niewidoczny.

5)    Z roztworu przechowywanego w temp. — 70°C można odzyskać RNA przez dodanie 3 M roztworu CH₃COONa do końcowego stężenia 0,3 M i odwirowanie (12000x0 w temp. 4°C przez 5 min).

6)    Jako poli(A) ⁺ RNA eluowane jest 1-2% całkowitego RNA wprowadzonego do kolumny.

7)    Kolumny z celulozą oligo(dT) można przechowywać w temp. 4°C i używać wielokrotnie. Regeneracji kolumn między ich użyciem dokonuje się przez kolejne przemywania NaOH, wodą i 1 x buforem kolumnowym.

8)    W przypadku prowadzenia elucji w temperaturze poniżej 18°C może dochodzić do wytrącania sarkozynianu dodecylu sodu, aby tego uniknąć, stosuje się LiCl zamiast NaCl w 1 x buforze kolumnowym.

9)    Zamiast oligo(dT) celulozy można stosować poli(U) Sephadex, którego użycie przyspiesza elucję.

10.1.4. Jednoczesne izolowanie DNA i RNA

Analiza molekularna uorganizowania i aktywności genów w obrębie danego układu komórkowego wymaga izolowania DNA i RNA najlepiej z tego samego źródła. Ma to szczególne znaczenie, gdy istnieją ograniczenia co do ilości materiału wyjściowego, np. w przypadku analizy kwasów nukleinowych z materiału biopsyjnego.

386