06

najczęściej stosuje się hydrolizę zasadową. Kwas rybonukleinowy poddany działaniu roztworów NaOH lub KOH (0,3-1,0 M) w temp. 37°C w ciągu kilkunastu godzin ulega całkowitemu rozkładowi do nuklcotydów. Powstaje przy tym mieszanina 2'-i 3'-monofosfonukleozydów.

Hydroliza zasadowa RN A jest możliwa dzięki istnieniu grupy —OH przy C₂ rybozy. Bliskie sąsiedztwo tej grupy wodorotlenowej i reszty kwasu fosforowego prowadzi w środowisku zasadowym do utworzenia cyklicznych nukleozydo-2',

3'-fosforanów', które następnie rozpadają się z równym prawdopodobieństwem do nukleozydo-2'- oraz nukleozydo-3'-fosforanów.

Powstanie takich cyklicznych fosforanów nukleozydów podczas hydrolizy zasadowej DNA jest niemożliw-e, ponieważ przy węglu 2' deoksyrybozy brak jest grupy hydroksylowej. Jest to przyczyną oporności kwasów deoksyrybonu klei nowych na działanie zasad. Skład nukleotydowy DNA oznacza się wdęc po jego hydrolizie kwasowej. Dostarcza ona różnych produktów' rozpadu DNA (lub RNA) zależnie od stężenia stosowanych kw^fasów, czasu inkubacji i temperatury. Krótkotrwałe ogrzewanie DNA lub RNA z kwasami o małych stężeniach (ok. 1 M) powoduje powstanie kwasu a pury nowego (łańcuchy polinukleotydowe pozbawione zasad pury-nowych). Wiązania zasad purynowych z resztami rybozy lub deoksyrybozy są bowiem bardziej wrażliwe na działanie kw^rasu niż wiązania zasad pirymidynowych. Najczęściej jednak stosuje się hydrolizę DNA i RNA stężonymi roztworami mocnych kwasów (takich jak H₂S0₄, HC10₄, HC1, HCOOH). Klasyczną metodą jest inkubacja kwasów nukleinowych w 72% roztworze HC10₄ (w temp. 100°C przez 1 godz.). W tych warunkach następuje całkowita hydroliza kwasów nukleinowych do wolnych zasad purynowych i pirymidynowych. Kwas deoksyrybonukleinowy często poddaje się hydrolizie kwasowej używając 96% roztworu HCOOH w zatopionych probówkach (w temp. 175°C przez 45 min). Stosowanie HCOOH jest wygodniejsze niż HCI0₄, gdyż HCOOH daje się łatwo odparować z hydrolizatu.

W analizie składu nukleotydowego hydroliza enzymatyczna nie ma zastosowania. Nukleazy rozkładają tylko specyficzne wiązania w cząsteczkach RNA i DNA, więc w rezultacie nie otrzymuje się pojedynczych nukleotydów.

Otrzymaną w wyniku hydrolizy mieszaninę zasad lub nukleotydów rozdziela się następnie chromatograficznie albo elektroforetycznie. Z metod chromatograficznych stosuje się kolumnową chromatografię jonowymienną, jedno- lub dwuwymiarową chromatografię bibułową lub cienkowarstwową.

Położenie rozdzielonych produktów hydrolizy kwasów nukleinowych na chro-matogramach określa się najczęściej metodami optycznymi. Związki purynowe i pirymidynowe (wolne zasady, nukleozydy i nuklcotydy) pochłaniają intensywnie promienie nadfioletowe w granicach długości fali 250-280 nm. Umieszczając więc chromatogram pod lampą kwarcową zaopatrzoną w odpowiedni filtr można zaobserwować ciemne plamy, będące obszarami, na których znajdują się związki pochłaniające w nadfiolecie. Metoda ta jest czuła (2-5 pg), umożliwia utrwalenie obrazu rozdziału badanych związków przez zrobienie zdjęć stykowych, a ponadto pozwala wykorzystać chromatogram do analiz ilościowych. Oznaczenia te polegają

416