08

Uwagi:

1)    Pozostałość niezhomogenizowanej tkanki należy poddać powtórnej procedurze opisanej w etapach 1. i 2.

2)    W celu otrzymania czystego RNA, po wykonaniu etapu 1. można zawiesinę poddać długotrwałemu ultrawirowaniu w gradiencie CsCl (Glisin i wsp. 1974).

3)    Wydajność przedstawionej metody (bez oczyszczania RNA) wynosi 200-400 ng genomowego DNA i 50-100 ng RNA z 1 mg tkanki.

4)    Metodę tę bez modyfikacji można stosować do komórek z hodowli, liści, drożdży i bakterii.

Ćwiczenie 10.15. Jednoczesne izolowanie DNA i RNA z małej objętości krwi

(C.G. Potter, A.C. Potter 1988: J. Immunol. Meth., 112:143-144)

Zasada: W metodzie tej wykorzystuje się ekstrakcję fenolem i izotiocyjanianem guanidyny. Pozwala to otrzymywać DNA i RNA jednocześnie z wielu małych (objętościowo lub ilościowo) próbek.

Materiał: Świeża krew.

Odczynniki:

1)    0,9% roztwór NaCl.

2)    Mieszanina: 6% dekstran (m.cz. 20 000)/75% uropolina (obj. 18:100).

3)    Bufor do lizy o pH 7,5: 5 M izotiocyjanian guanidyny - 10 mM EDTA - 50 mM Tris - 8% 2-merkaptoctanol.

4)    4 M roztwór LiCl.

5)    Fenol nasycony (pH 8,0).

6)    Mieszanina: chloroform/alkohol izoamylowy (obj. 24:1).

7)    96% roztwór etanolu.

8)    70% roztwór etanolu.

9)    Bufor TE o pH 8,0: 10 mM Tris/HCl - 1 mM EDTA

10)    3 M roztwór LiCl.

11)    Bufor solubilizacyjny o pH 7,5: 10 mM Tris/HCl - 1 mM EDTA - 0,1% SDS.

12)    3 M roztwór CH₃COONa (pH 5,2).

Wykonanie:

1.    1 ml krwi zmieszać z 1 ml 0,9% roztworu NaCl (odcz. 1). 1 ml zmieszanej krwi nawarstwić na 0,5 ml mieszaniny (odcz. 2) w probówce Eppendorfa. Odwirować (11000 x g przez 1 min) w wirówce Eppendorfa.

2.    Zebrać wyraźnie widoczną warstwę limfocytów, wprowadzić do nowej probówki Eppendorfa, zawiesić w 1 ml 0,9% roztworu NaCl i odwirować (11000x0 przez 10 s); supernatant odrzucić.

3.    Dodać 100 pl buforu (odcz. 3) i wytrząsać do osiągnięcia całkowitej lizy komórek. Wprowadzić 700 pl 4 M roztworu LiCl (odcz. 4) i inkubować w temp. 4°C przez co najmniej 3 godz. Odwirować (11000x0 w temp. 4°C przez 15 min), zebrać supernatant i rozcieńczyć go wodą do końcowego stężenia LiCl równego 1 M; osad zachować do izolowania RNA.

4.    Rozcieńczony supernatant ekstrahować 2-krotnie fenolem (odcz. 5) i raz chloroformem (odcz. 6). Wytrącić DNA 2 objętościami etanolu (odcz. 7) i nawinąć na bagietkę. Płukać DNA 2 razy 70% roztworem etanolu, suszyć w powietrzu i rozpuszczać w buforze TE (odcz. 9).

388