06

2.    Sproszkowaną tkankę przenieść do 50-ml zakręcanej probówki polipropylenowe;,, zawierającej 30 ml schłodzonego buforu homogenizacyjnego (odcz. 1) i wymieszać. Niską temperaturę zawiesiny należy utrzymywać poprzez umieszczenie probówki w pokruszonym lodzie.

3.    Przenieść zawiesinę do umieszczonego w lodzie homogenizatora Dounce’a o pojemności 40-50 ml i homogenizować poprzez 4-krotne przeprowadzenie ciasnego tłoka (typu B). Przenieść uzyskany homogenat do 50-ml zakręcanej probówki polipropylenowej umieszczonej w lodzie.

4.    Homogenat odwirować (1000 xg w temp. 4°C przez 10 min). Supernatanl ostrożnie usunąć za pomocą pipety i zachować osad, który zawiera dużą ilość nieuszkodzonych jąder komórkowych.

5.    Osad zawiesić w 3 ml odczynnika 2 poprzez intensywne mieszanie. Dodać 0,5 ml roztworu pronazy (odcz. 3) oraz 4 ml odczynnika 4, wymieszać i inkubować w łaźni wodnej o temp. 45^CC do następnego dnia (minimum 6 godz.).

6.    Lizat schłodzić na lodzie, dodać 4 ml odczynnika 5, 1 ml odczynnika 6 i wymieszać. Następnie oszacować objętość lizatu, dodać 2-krotnie większą objętość 96% roztworu etanolu schłodzonego do temperatury — 20°C (odcz. 7) i wymieszać. Nitkowaty, galaretowaty osad DNA wyłowić z probówki za pomocą bagietki, przepłukać 2-krotnie w 5 ml 70% roztworu etanolu o temp. — 20°C (odcz. 8) w kolejnych probówkach i ostatecznie przenieść do probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml, zawierającej 200 pl odczynnika 2. Osad powinien przynajmniej częściowo rozpuścić się. W tym celu należy intensywnie mieszać próbkę przez kilka minut.

7.    Żelowatą zawiesinę inkubować w szczelnie zamkniętej probówce Eppendorfa, w łaźni wodnej (temp. 95°C przez 10 min). Następnie probówkę schłodzić przez umieszczenie w pokruszonym lodzie.

8.    Do preparatu DNA (zazwyczaj pozostaje on na tym etapie w formie żelu) dodać 100 pl odczynnika 9 oraz 100 pl roztworu nukleazy PI (odcz. 10), wymieszać i inkubować w łaźni wodnej (w temp. 45ⁿC przez 45 min).

9.    Do hydrolizatu dodać 20 pl odczynnika 11 i 10 pl roztworu zasadowej fosfatazy (odcz. 12), wymieszać i inkubować godzinę w łaźni wodnej (w temp. 37°C przez 1 godz.).

10.    Końcowy produkt hydrolizy roztwór zawierający wszystkie typy nukleo-zydów wchodzących w skład wyizolowanego DNA odwirować w mikrowirówce przy maksymalnych obrotach przez 10 min. Następnie ostrożnie zebrać pipetą ²/₃ roztworu nie dotykając dna probówki, przenieść do świeżej probówki Eppendorfa i przechowywać w 4°C do czasu analizy chromatograficznej.

11.    Wykonać analizy chromatograficzne roztworów wzorcowych 5-Me-dC oraz dC i hydrolizatów' DNA (nastrzyki 20 pl) za pomocą zestawu HI*LC wyposażonego w pompę, kolumnę C₁₈ do chromatografii podziałowej fazy odwróconej (np. kolumnę Ultrasphere C_l8 firmy Beckman, o wymiarach: 25 cm długości, 4,6 mm średnicy wewnętrznej i 5-pm średnicy ziarna chromatograficznego), ręczny lub automatyczny dozownik prób. detektor UV przesyłający dane chromatograficzne do komputera z oprogramowaniem umożliwiającym integrację chromatogramów.

426