img084 5

Wykonanie: Do czystej i suchej /lewki (50 ml) odważyć około I g CM-celulozy, zawiesić w buforze I i przenieść stopniowo do kolumny szklanej, aż do uformowania złoża kationitu o wymiarach 9x4 cm. Pozostawić zaledwie kilkumilimetrowy warstwę buforu I nad złożem, zamknąć kurek kolumny i na wierzchołek złoża wprowadzić ilościowo za pomocą pipety badany roztwór histonu (10 mg histonu w naczynku wagowym + 2 ml buforu I). Naczynko po roztworze histonu przemyć | niewielką ilością buforu I i ciecz z przemycia wprowadzić nad złoże kationitu. I ak przygotowaną kolumnę chromatograficzną umocować w statywie kolektora frakcji w ten sposób, aby do jej otworu górnego wchodziło zwężone doprowadzenie rozdzielacza napełnionego eluentem, a zwężone dolne zakończenie kolumny znaj- | dowało się nad lewarkiem, umożliwiającym zbieranie w probówkach, umieszczonych na stoliku kolektora, eluatów o stałej objętości 5 ml.

Złoże kationitu z zaadsorbowanym histonem przemyć następującymi roztworami (elucja skokowa; szybkość wycieku l ml/min): 1) Bufor I: 10 probówek (50 ml); wymycie zanieczyszczeń. 2) Bufor II: 20 probówek (100 ml); frakcja silnie lizynowa (Lys/Arg>4). 3) 0,01 M HC1: 20 probówek (100 ml); frakcja umiarkowanie lizynowa (1 <Lys/Arg<4). 4) 0,02 M HC1: 10 probówek (50 ml); frakcja argininowa (Lys/Arg< 1). Absorbancję eluatów oznaczyć przy z. = 280 nm.

Na papierze milimetrowym wykreślić układ współrzędnych: na osi odciętych za-1 znaczyć objętość eluatów (nr probówki), a na osi rzędnych — odpowiednie absor-bancje. Wykres obrazuje rozdział histonu grasicy na 3 frakcje. Procentowy udział tych frakcji w całkowitym histonie grasicy obliczyć, uwzględniając powierzchnie pól wykresu zajętych przez poszczególne frakcje oraz sumaryczną powierzchnię zajętą przez wykres (w mm²).    ® u*a_ga: Zc względu na ograniczoną liczbę godzin ćwiczeń zastosowano technikę Johnsa i wsp. z 1960 W (w modyfikacji badaczy japońskich z 1968 r.). Umożliwia ona rozdział chromatograficzny 10 mg histonu w ciągu 5-6 godzin. Chromatografia ta ma jednak charakter raczej analityczny niż preparatywny. ^w oryginalnej metodzie Johnsa startuje się co najmniej ze 100 mg histonu, a rozdział chromatograficznyj przeprowadza się w ciągu 2-3 dni, w pokoju — chłodni.

Ćwiczenie 4.4. Chromatografia jonowymienna preparatu cytochromu c na Amberlite IRC -50 z zastosowaniem ciągłego gradientu stężeń (patrz ćw. 11.47).

4.4. CHROMATOGRAFIA PODZIAŁOWA

4.4.1. Ogólna charakterystyka chromatografii podziałowej

C hromatografia podziałowa jest metodą opartą na podziale solutu pomjędzy dwie nie mieszające się ze sobą fazy ciekłe, z których jedna jest ruchoma — najczęściej to rozpuszczalnik organiczny, a druga nieruchomo osadzona na porowatym nośniku to najczęściej woda. Porowaty nośnik może mieć postać kolumny lub bibuły. Warunkiem decydującym o rozdziale substancji są różnice w ich rozpuszczalności w fazie ruchomej i nieruchomej, a tym samym różnice we współczynnikach podziału tych substancji między dwie nicmieszającc się ze sobą fazy ciekłe.

Prawo podziału solutu. Układy utworzone przez dwa nicmicM/ującc się ze sobą Rolwcnty i rozpuszczający się w nich obu solu! podlega ją pewnej regularności nazwanej prawem Nernsta. Głosi ono: w układzie utworzonym przez dwie niemie H/ające się ze sobą fazy ciekłe i wspólny dla nich solut, stosunek stężenia tego solutu w fazie 1 (c*,) do jego stężenia w fazie 2 (c₂) jest w stanic równowagi wielkością stałą, zależną tylko od temperatury i właściwości substancji tworzących roztwory, a niezależną od ilości substancji rozpuszczonej:

cjc₂ = k

gdzie: c, i c₂ — stężenia molowe składników w fazie 1 i 2, zaś k współczynnik podziału.

Prawo podziału jest słuszne w przypadku, gdy cząsteczki substancji rozpuszczonej mają w obu fazach jednakową wielkość; jeżeli w jednej z faz zachodzi dysocjacja lub asocjacja cząsteczek, prawo Nernsta ulega modyfikacjom.

Wartość współczynnika podziału nie zależy od ilości substancji rozpuszczonej w przypadku układów doskonałych, do których zbliżają się roztwory rozcieńczone. Ulega ono jednak zmianie dla roztworów stężonych oraz wówczas, gdy graniczące luzy mieszają się częściowo ze sobą, np. gdy rozpuszczalność substancji w jednej i drugiej fazie zmienia się pod wpływem temperatury czy dodania soli do fazy wodnej. W praktyce dogodniej wyrażać stężenie solutu, ulegającego podziałowi, nie w molach, lecz w gramach na jednostkę objętości, gdyż w ten sposób uwzględnia się wszystkie rodzaje cząsteczek niezależnie od stanu ich agregacji (cząsteczki, jony, dimery itp.). Tak uzyskana wartość cjc₂ różni się od wartości współczynnika podziału k i nosi nazwę: stosunek podziału K:

K =

"faza mchotna nieruchoma

lub

gilzie c wyrażono w % (m/v).

/ największą prędkością przesuwa się składnik wykazujący największą wartość stosunku podziału.

Miarą selektywności rozdziału dwóch substancji A i B w danym układzie jest stopień rozdziału, którego wartość określa wzór:

P = *a/*b

gdzie: K_A stosunek podziału substancji A, zaś K_B — stosunek podziału substancji Ił między fazę ruchomą i nieruchomą.

Rozdział chromatograficzny obu substancji (A i B) jest tym łatwiejszy, im bardziej wartość fi różni się od jedności.

Rozpuszczalność substancji a stosunek podziału. Zagadnienie rozpuszczalności sprowadza się do wzajemnego oddziaływania cząsteczek solwcntu i solutu. Rodzaj i wartość tych sił zależą od natury chemicznej, wielkości i budowy cząsteczek solwcntu oraz solutu.

113