01

0    m.cz. 45000-65000. Fragmenty tej samej długości mogą być także formowane in vivo, m.in. w trzustce i wątrobie. Metoda izolowania DNA opisana w tym ćwiczeniu zawiera izolowanie jąder, a następnie ekstrakcję DNA rozpuszczalnikami organicznymi.

Materiał: Wątroba szczura.

Odczynniki:

1)    0,25 M roztwór sacharozy.

2)    Roztwór do homogenizacji: 2,2 M sacharoza - 3 mM CaCl₂.

3)    Roztwór o składzie: 1 M sacharoza - 1 mM CaCl₂.

4)    RNaza o stężeniu 10 mg/ml w 0,15 M roztworze NaCl (pH 5,0).

5)    Roztwór do lizy jąder komórkowych: 1% SDS - 1 mM EDTA.

6)    Roztwór pronazy o stężeniu 20 mg/ml.

7)    4 M roztwór NaCl.

8)    4 M roztwór NaC10₄.

9)    Mieszanina: alkohol izoamylowy/chloroform (obj. 1:5).

10)    Etanol.

11)    Bufor TE o pH 7,6: 10 mM Tris/HCl - 1 mM EDTA.

Ważniejsze przyrządy: Homogenizator nożowy i tłokowy, łaźnia wodna o zakresie temperatur obejmującym 90°C.

Wykonanie:

1.    Świeżo pobraną wątrobę szczura wypłukać w zimnym 0,25 M roztworze sacharozy (odcz. 1) i homogenizować w homogenizatorze nożowym w chłodni. Rozdrobnioną wątrobę homogenizować w buforze do homogenizacji (odcz. 2, temp. 4°C), biorąc 12 części buforu na 1 część zmielonej tkanki.

2.    Odwirować homogenat (40000x0 w temp. 4°C przez 1 godz.); osad jąder zawiesić w odczynniku 3; wirować (1000 x g w temp. 4°C przez 10 min), zebrać osad oczyszczonych jąder komórkowych i zawiesić je w buforze do lizy (odcz. 5, 1 -2 ml buforu na ilość jąder otrzymaną z 1 g tkanki).

3.    Dodać RNazę (odcz. 4) do końcowego stężenia 200 pg/ml, poddając ją wstępnej inkubacji (w temp. 90°C przez 10 min), a następnie inkubować w temp. 37°C przez

1    godz.

4.    Dodać pronazę (odcz. 6) do końcowego stężenia 300 pg/ml i inkubować w temp. 37°C przez 2 godz.

5.    Doprowadzić stężenie NaCl do 1 M używając 4 M NaCl (odcz. 7).

6.    Odwirować (10000 x g w temp. 4°C przez 30 min) i zachować supernatant.

7.    Dodać 4 M roztworu NaC10₄ (odcz. 8) w takiej ilości, aby końcowe stężenie wynosiło 1 M. Ekstrahować 4 razy mieszaniną alkohol izoamylowy/chloroform (odcz. 9), wirując po każdej ekstrakcji, tak jak w etapie 6.

8.    Wytrącić DNA za pomocą 2 objętości zimnego etanolu (odcz. 10) i odzyskać przez wirowanie (27 000 x g w temp. 4°C przez 30 min).

9.    Rozpuszczać DNA w buforze TE (odcz. 11).

Uwagi:

1)    Wydajność tej metody sięga 95%.

2)    Zawartość RNA nie powinna przekraczać 1%, a białka 2%.

381