01

z otoczki hydratacyjnej. Analizując pH-metryczne krzywe topnienia, wyznacza się analogiczne parametry charakteryzujące krzywe, jak w przypadku temperaturowych krzywych topnienia, a więc: efekt hiperchromowy (A£), wartość pH, przy której efekt hiperchromowy równa się połowie wartości maksymalnej (pHJ i szerokości przedziału topnienia (ApH), czyli zakres wartości pH, w którym zachodzi proces denaturacji.

Materia): Roztwór DNA o stężeniu 25 gg/ml w 0,014 M roztworze NaCl.

Odczynniki:

1)    0,1 M roztwór HC1.

2)    0,5 M roztwór NaOH.

3)    0,014 M roztwór NaCl.

Wykonanie: Pobrać 10 ml roztworu DNA. Zmieniać stopniowo wartość pH badanej próbki dodając 0,1 M roztwór HC1 (denaturacja kwasowa) lub 0,5 M roztwór NaOH (denaturacja zasadowa). Rejestrować zmiany absorbancji w paśmie 260 nm dla każdej zmiany wartości pH o 0,1 jednostki (w regionach przegięcia krzywej — co 0,05 jednostki). Pomiar wykonywać wobec 0,014 M roztworu NaCl o pH równym próbom badanym. Wyznaczyć krzywe zależności:

AJ l*o =/( PH)

gdzie: A₀ — początkowa absorbancja roztworu DNA o pH 7, A_x — absorbancja roztworu DNA w ściśle określonym pH.

Z otrzymanych krzywych wyznaczyć wartości AE, pH_m i ApH.

Ćwiczenie 10.23. Frakcjonowanie DNA natywnego i zdenaturowanego na kolumnach z hydroksyapatytu (G. Bernardi 1969: Biochim. Biophys. Acta, 174:435-448)

Zasada: Jedną z bardziej dogodnych metod rozdzielenia formy natywnej i zdenatu-rowanej DNA jest frakcjonowanie na hydroksyapatycie. O powinowactwie kwasów nukleinowych do hydroksyapatytu decydują głównie różnice w konfiguracji szkieletu cukrowo-fosforowego. Niewielki wpływ na interakcję kwas nukleinowy-hydro-ksyapatyt mają oddziaływania zasad azotowych i rozmieszczenie grup fosforowych. Chromatograficzne właściwości zdenaturowanego DNA są zupełnie odmienne od właściwości natywnej wielkocząsteczki. Zdenaturowany DNA eluują stężenia molowe buforu fosforanowego wyraźnie mniejsze niż w przypadku cząsteczek natywnych (rys. 10.6).

Materiał: Roztwór DNA o stężeniu 50 |ig/ml w 0,0IM buforze fosforanowym.

Odczynniki:

1)    0,01 M, 0,05 M, 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,3 M i 0,5 M bufory fosforanowe (pH 6,8).

2)    0,5 M roztwór CaCl₂.

3)    0,5 M roztwór Na₂HP0₄.

4)    0,1 M bufor fosforanowy (pH 6,8).

5)    40% roztwór NaOH (m/m),

6)    Zawiesina hydroksyapatytu w 0,01 M buforze fosforanowym (pH 6,8). Do 400 ml H₂0 w 6-lit-rowej kolbie wkraplać równocześnie 2 1 0,5 M roztworu Na₂HP0₄ i 2 I 0,5 M roztworu CaCl₂ z prędkością 4,5 ml/min. Zawartość zlewki mieszać mieszadłem mechanicznym. Po oddzieleniu się osadu zlać supernatant. Osad przemyć 4-krotnie 4 I H₂0 i pozostawić na 15 godz., a po

401