02

zdekantowaniu supernatantu — zalać 4 l H₂0 oraz 100 ml 40% roztworu NaOH. Uzyskaną zawiesinę gotować przez 1 godz. stale mieszając. Supematant zlać, natomiast osad przemyć 4-krotnie 4 1 H₂0, odrzucając drobne cząstki. Po przemyciu osad zawiesić w 4 1 0,01 M buforu fosforanowego. Całość doprowadzić do wrzenia równomiernie mieszając, a następnie zdekantować, ponownie dodać do osadu 4 1 0,01 M buforu fosforanowego i gotować zawiesinę przez 5 min. Procedurę powtórzyć, zwiększając czas gotowania do 15 min. Hydroksyapatyt przechowywać w 0,01 M buforze fosforanowym (pH 6,8). Oczywiście hydroksyapatyt można również zakupić.

Rys. 10.6. Frakcjonowanie DNA z grasicy bydlęcej na kolumnie z hydroksyapatytu w skokowym gradiencie stężeń buforu fosforanowego (pH 6,8). a) natywny DNA, b) DNA denaturowany w temp. 90°C i szybko ochłodzony, c) DNA denaturowany w temp. 100°C i szybko ochłodzony (wg: Bernardi 1969)

Wykonanie: Do kolumny chromatograficznej o średnicy 1 cm wprowadzić zawiesinę hydroksyapatytu w 0,01 M buforze fosforanowym i uformować złoże o wysokości 3 cm. Hydroksyapatyt przemyć 0,01 M buforem fosforanowym do zaniku absorban-cji w 260 nm. Na tak przygotowane złoże nanieść 5 ml preparatu DNA zdenaturo-wanego w temp. 100°C i 5 ml preparatu natywnego w 0,01 M buforze fosforanowym (pH 6.8).

DNA eluować kolejno buforem fosforanowym o następujących stężeniach: 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,3 M i 0,5 M. Stosując każdy z tych eluentów zbierać po 6 frakcji o objętości 4 ml. Szybkość wypływu z kolumny ustalić na 0,8 ml/min. Zmierzyć absorbancję przy 260 nm dla wszystkich frakcji uzyskanych z kolumny i wykreślić profil rozdziału chromatograficznego.

402