05

4) Opisana metoda charakteryzuje się znacznym zakresem tolerancji czasu inkubacji w temp. 50"C, który może zostać przekroczony o 1 godz. bez wpływu na wynik pomiarów, przy pozostawieniu próbek w temperaturze pokojowej na 2 godz. po inkubacji.

10.3.2. Zastosowanie enzymów restrykcyjnych w analizie DNA

Enzymy restrykcyjne trawią dwuniciowy DNA po rozpoznaniu w nim specyficznej sekwencji. Spośród 3 klas enzymów restrykcyjnych największe znaczenie w biologii molekularnej mają enzymy klasy II, a wśród nich endonukleazy restrykcyjne, dokonujące trawienia po rozpoznaniu specyficznej sekwencji, oraz metylazy, które mogą modyfikować sekwencję rozpoznawaną przez endonukleazy. Źródłem enzymów restrykcyjnych są bakterie; obecnie wyizolowano ok. 300 restryktaz. Większość enzymów restrykcyjnych klasy II rozpoznaje sekwencje zawierające 4-8 nukleotydów. Sekwencja rozpoznawana przez większość endonukleaz restrykcyjnych klasy II jest palindromowa, co oznacza, że czytana w kierunku 5' —► 3' lub 3' -*5' sekwencja obydwu nici jest taka sama (tab. 10.5).

Tabela 10.5. Niektóre enzymy restrykcyjne klasy II

Enzym	Źródło	Rozpoznawana sekwencja*	Oczekiwana średnia długość ludzkiego DNA (kpz) po trawieniu enzymem
Alul	Arlhrobuaer luteus	AGCT	0,3
Hae III	Hemophilus aeyyptus	GGCC	0,6
Taq\	Thermus aquaticus	TOGA	1.4
Mnll	Moraxella noniiąuefaciens	CCTC/GAGG	0,4
//(Will	Hemphiłus łnfluenzae Rd	AAGCTT	3,1
EcoRI	Escherichia coli R	GAATTC	3,1
BamHI	Bacillta amy!olique/aciens H	GGATCC	7,0
F^rl	Prooidencla Stuart ii	CTGCAG	7.0
Mjłl	Mlcrocoleus	CCTNAGG	7.0
Swoi	Serratia marcescens	CCCGGG	78
BssHI	Baciłlus stearoihermopliilus	GCGCGC	390
Not\	Nocardia ot i t idis-caviarum	GCGGCCGC	9766

• N oznacza dowolny nuklcotyd

Palindromowość można rozważać jako skutek istnienia w sekwencji osi symetrii. W większości przypadków punkt trawienia nie wypada na osi symetrii, czego konsekwencją jest istnienie wolnych końców 5' lub 3', które są nazywane czasem lepkimi końcami, gdyż może dochodzić do sparowania pomiędzy nimi ze względu na ich komplementarność, będącą konsekwencją palindromiczności sekwencji rozpoznawanej. Czasami punkt trawienia leży dokładnie na osi symetrii, dając produkty trawienia (fragmenty restrykcyjne) o tzw. tępych końcach; w takim przypadku nie będzie możliwe spontaniczne sparowanie pomiędzy końcami fragmentów restrykcyjnych otrzymanych na skutek działania takiego enzymu.

Enzymy* które rozpoznają te same sekwencje, mają nazwę: izoschizomery.

435