09

1 w«gi:

1)    Akrylamid wykazuje silne właściwości ncurotoksyczne i jest łatwo wchłaniany przez skórę. Używając go należy stosować rękawice i maskę. Mimo że poliak-rylamid jest uważany za nietoksyczny, trzeba się z nim także obchodzić ostrożnie, gdyż może on zawierać niewielką ilość niespolimeryzowanego akrylamidu.

2)    Podczas składowania akrylamid i ófsakrylamid ulegają przekształceniu odpowiednio do kwasu akrylowego i óisa kryl owego. Reakcja ta jest katalizowana przez światło i zasady. Należy sprawdzać, czy pH roztworu akrylamidu nie jest większe od 7,0 i stosować do przechowywania naczynia z ciemnego szkła. Co miesiąc powinno się sporządzać świeże roztwory.

3)    10% roztwór (NH₄)₂S₂O_b (etap 2.) można przechowywać w temp. 4 C przez kilka tygodni.

4)    Coraz powszechniejsze są aparaty, w^f których nie trzeba oklejać płyt taśmą (etap 4.).

5)    Po spolimeryzowaniu żelu (etap 8.) można go przechowywać przez 1-2 dni. W tym celu należy go obłożyć papierowymi ręcznikami namoczonymi w buforze 1 x TBE, całość zawinąć w' folię i umieścić w miejscu o temp. 4"C.

6)    Jest bardzo istotne, aby przepłukać ścianki studzienek natychmiast po wyjęciu grzebienia, w przeciwnym razie fragmenty niespolimeryzowanego akrylamidu pozostałe w studzienkach mogą spolimeryzować powodując nieregularny kształt studzienek, co może zaburzać przebieg elektroforezy.

7)    Bardzo ważne jest, aby używać jednej porcji buforu elektroforctycznego do sporządzania żelu i do napełniania zbiornika do elektroforezy; niewielkie różnice w sile jonowej lub pH mogą w istotny sposób wpływać na ruchliwość clektro-foretyczną DNA.

8)    Zazwyczaj do studzienki o wymiarach 0,5 cm x 0,3 cm x 1 mm wprowadza się 3-5 (d próbki DNA (etap 10.).

9)    Elektroforeza w żelach bez denaturantów' jest zwykle przeprowadzana pod napięciem dającym natężenie pola elektrycznego w żelu 18 V/cm (etap 12.), zastosowanie wyższych napięć może spowodować nierównomierne nagrzewanie się żelu. szczególnie w jego środkowym obszarze, wygięcie pasm DNA (efekt uśmiechu), a nawet topnienie krótkich fragmentów'.

10)    Należy pamiętać, żc poliakrylamid tłumi fluorescencję bromku ctydyny, wobec czego nie jest możliwe wykrywanie pasm zawierających mniej niż 10 ng DNA przez zastosowanie tego fluoroforu (etap 12.). Bromek etydyny jest silnym mutagenem i powinien być poddany procedurze dekontaminacji (patrz ćw. 10.34).

Ćwiczenie 10.42. Odzyskiwanie DNA po elektroforezie w żelu poliakrylamidowym (A.M. Maxam, W. Gilbert 1977: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:560-572)

Zasada: Po zlokalizowaniu w żelu poliakrylamidowym cząsteczek DNA, które mają być odzyskane, wycina się zawierające je fragmenty żelu i następnie ekstrahuje DNA, aby był on w możliwie niewielkim stopniu zanieczyszczony poliakrylamidem. Można to osiągnąć przez kilkakrotne wirowanie i filtrację, na przykład z użyciem

449