20101027082

I

Laboratorium 4 ZASTOSOWANIE FILTRACJI ŻELOWEJ

DO ODSALANIA I FRAKCJONOWANIA BIAŁEK

1    Przygotowanie kolumny.'

Kolumnę chromatograficzną (cf> ok 2 cm) wypełnioną żelem Sephadex G-100 przygotuj do naniesienia próby W tym celu nałoży zamknąć wylot kolumny, odłączyć zbiornik z eluentem (0,9% roztwór NaCI) i poprzez otwarcie wylotu kolumny usunąć nadmiar roztworu znad powierzchni Żelu tak. by nie doprowadzić do zapowietrzenia się kolumny Następnie zamknij wylot kolumny

2    Nanoszenie próby na kolumnę i alucm

Przy zamkniętym wypływie kolumny nalóz ostrożnie nu powierzchnię żelu 1 ml badanej mieszaniny Podstaw pod wyłot kolumny probówkę miarową i otwórz kranik aby próbka wsiąkła w górę żelu pod wpływem ciśnienia grawitacyjnego (uważaj, Zęby nie wysuszyć powierzchni zełuj Następnie ponownie zamknij wylot kolumny i ostrożnie nanieś na powierzchnię Zeiu około i ml 0.9% roztworu NaCi. dokładnie spłukując ze ścianek kolumny pozostałości nałożonej mieszaniny Otwórz kranik, aby naniesiony roztwór wsiąknął w gorę Zeiu. rve wysuszając jego gomezcłini Znowu zamknę wypływ kolumny

Po wykonaniu tych czynności można przystąpić do właściwego rozdziału W rym cetu na powierzchnię żelu nanieś ostrożnie 0.9% roztwór NaCi do wysokości umotfcwiefącej po szcza**ym podłączeniu zbiornika z eluentem) otrzymanie nłaprzerwarego słupa eluującej cieczy Następnie podłącz szczelnie kolumnę ze zbiornikiem z ełuentem otwórz wylot kolumny , prowadź eftjqę z szybkością około 1 mL / mm zbierając do probówe* rruarowych frakcje o objętości 4 -ra Kontynuuj zbieranie frakcji aż do pełnego wyełuowen>e crvgrn>enu potasu

3.    Raoeneraoa kolumny

Po ukończeniu frakcjonowania przygotuj kolumnę do następnych rozdziałów przepuszczając przez mą około 100 mL 0.9% roztworu NaCi

4.    OoCczenia:

Zmierz sbsorbancję uzyskanych frakqi dla błękitu dekstranowego przy długości fali A = 610 nm. dla hemoglobiny przy A = 540 nm. a dla chromianu potasu przy A = 390 nm.

Wykonaj na papierze milimetrowym wykres zależności absorbanoi (os Y) od objętość ełucyywj (oś X) dla trzech uzyskanych frakcji

Oblicz wartość współczynnika podziału (K«) dla błęłutu dekstranowego, hemoglobiny i chromianu potasu zgodnie z poniższą tabelą

Składnik	V0(mL)	V. (mL)	V.-Vo
Błękit dekstranowy
Hemoglobina
Chromian potasu

gdzie:

V₀ - objętość rozpuszczalnika zalegającego między ziarenkami żelu, wyznaczana jako objętość elucji od chwili naniesienia próbki do momentu wypłynięcia substancji wysokocząsteczkowsj (błękitu dekstranowego) z kolumny

V, - objętość niezbędna do wyeluowania danej substancji z kolumny, wyznaczana jako objętość elucji od chwili naniesienia próbki do momentu wyjścia z kolumny danego składniku mieszaniny V| - całkowita objętość kolumny (tt r*h. gdzie r - promień kolumny, h- wysokość słupa żelu)

Uwaga: nie zapomnij zmierzyć średnicy kolumny i wysokości słupa żelu w używanej w doświadczeniu kolumnie