20101027084

Laboratorium 4 ZASTOSO WANIĘ FILTRACJI ŻELOWEJ

DO ODSALANIA I FRAKCJONOWANIA BIAŁEK

1.    Przygotowanie kolumny;

Kolumnę chromatograficzną ($ ok 2 cm) wypełnioną żelem Sephadex G-100 przygotuj do naniesienia próby. W tym celu należy zamknąć wylot kolumny, odłączyć zbiornik z ełuentem (0,9% roztwór NaCI) i poprzez otwarcie wylotu kolumny usunąć nadmiar roztworu znad powierzchni żelu tak, by nie doprowadzić do zapowietrzenia się kolumny Następnie zamknij wylot kolumny.

2.    Nanoszenie próby na kolumnę i elucia.

Przy zamkniętym wypływie kolumny nałóż osi rożnie na powierzchnie? żaki 1 mL badanej mieszaniny. Podstaw pod wylot kolumny probówkę miarową i otwórz kranik, aby próbka wsiąknęła w górę żelu pod wpływem ciśnienia grawitacyjnego (uważni, zęby nie wysuszyć powierzchni żelu) Następnie ponownie zamknij wylot kolumny i ostrożnie nanieś na powierzchnię ze'u około 1 mL 0.9% roztworu NaCI, dokładnie spłukując ze ścianek kolumny pozostałości nałożonej mieszaniny Otwórz kranik, aby naniesiony roztwór wsiąknął w górę zolu, me wysuszając .ego powierzchni Znowu zamknij wypływ kolumny

Po wykonaniu tych czynności można przystąpić do etażowego rozdzraiu W tym cetu na powierzchnię żelu nanieś ostrożnie 0.9% roztwór NaCI do wysokości umożliwiające? (po szczelnym podłączeniu zbiornika z ełuentem) otrzymanie nieprzerwanego stupa eiuujace; oeczy Następnie podłącz szczelnie kolumnę ze zbiornikiem z ełuentem. otwórz wylot kolumny i. prowadź ełucję z szybkością około 1 mL / mm. zbierając do probówek miarowych frakcje o objętości 4 mi Kontynuuj zbieranie frakcji az do pełnego wysk mwermi chromianu potasu

3.    Reoeneracia kolumny

Po ukończeniu frakcjonowania przygotuj kolumnę do nnstępnycn rozdziałów przepuszczając przez nią około 100 mL 0.9% roztworu NaCi

4.    ObBczema:

Zmierz ateorbancję uzyskanych frakcji dla błękitu dekstranowego przy długości fak \ = 610 nm dla hemoglobiny przy A = 540 nm, a d'a chromianu potasu przy A = 390 nm.

Wykonaj na papierze milimetrowym wykres zależności abeorbancji (oś Y) od objętości akcyjnej (oś X) dla trzech uzyskanych frakcji

Oblicz wartość współczynnika podziału (K«,) dla błękitu dekstranowego, hemoglobiny i chromianu potasu zgodnie z poniższą tabelą

Składnik	V.l»nL) V,lmL) _V,-V.			K— ^m V>- V> / Vl-Vę |
Błękit dekstranowy
Hemoglobina
Chromian potasu

gdzie:

V₀ - objętość rozpuszczalnika zalegającego między ziarenkami żelu, wyznaczana jako objętość elucji od chwili naniesienia próbki do momentu wypłynięcia substancji wysokocząsteczkowet (błękitu dekstranowego) z kolumny

V, - objętość niezbędna do wyeluowania danej substancji z kolumny, wyznaczana jako objętość elucji od chwili naniesienia próbki do momentu wyjścia z kolumny danego składnika mieszaniny V_t - całkowita objętość kolumny (tt r^h, gdzie r - promień kolumny, h- wysokość stupa żełu)

Uwaga: nie zapomnij zmierzyć średnicy kolumny i wysokości słupa żalu w używanej w doświadczeniu kolumnie