20101027083

Laboratorium 4 ZASTOSO WANIĘ FILTRACJI ŻELOWEJ

DO ODSALANIA I FRAKCJONOWANIA BIAŁEK

1    Przygotowanie Kolumny:

Kolumnę chromatograficzną (cj) ok 2 cm) wypełnioną zolom Sephadex G-100 przygotuj do naniesienia próby W tym celu naloty zamknąć wylot kolumny, odłączyć zbiornik z ełuentem (0,9% roztwór NaCt) i poprzez otwarcie wylotu kolumny usuną'' nadmiar roztworu znad powierzchni żelu tak. by nie doprowadzić do zapowietrzeniu nę kolumny Następnie zamknij ■.*,//.> kolumny

2    Nanoszenie próby na Kolumnę i olucfo

Przy zamkniętym wypływie kolumny nalóz osi rożnie ra powierzchnię zełu 1 ml (wdanej mieszaniny Podstaw pod wylot kolumny probówkę miarową I otwórz kranik aby próbka wwanneia w górę żelu pod wpływem ciśnienia grawitacyjnego (uważaj Żeby me wysuszyć powwrzcm zełu) Następnie ponownie zamknij wylot kolumny i ostrożnie r anieś n.j powierzchnię zełu około 1 mL 0,9% roztworu NaCl. dokładnie spłukując ze Scenek kolumny pozostałości nałożonej nasaaamny Otwórz kranik, aby naniesiony roztwór wsiąknął w gorę zełu. nłe wysuszając jego |nnwwrcTmi Znowu zamknij wypływ Kolumny

Po wykonaniu tych czynności można przystąpić do włeścwego rozdziału M rym cełu na powierzchnię żelu nanieś ostrożnie 0,9% roztwór NeCi do wysckoao umczJnwającej po szczwrrpn podłączeniu zbiornika z ełuentem) otrzymanie nieprzerwanego sk i;a    owczy Nactępnw

podłącz szczelnie kolumnę ze zbiornikiem z ełuentem. ofworz wylot kołwmy i orowadZ —z szybkością około 1 mL / mm zbierając do proOOwe« miarowych frakcje o objętość a rrs Kontynuuj zbieranie frakcji aż do pełnego wyełuowenta crroimanu potasu.

3.    Reaenęraaa kolumny

Po ukończeniu frakcjonowana przygotuj kolumnę de następnych, lozcnarow przepuszcz^ąc przez mą około 100 mL 0.9% roztworu NaO

4.    Obliczenia

Zmierz absorbancję uzyskanych frakcji dla błękitu dekstranowego przy iS-ugosc fas V = SIO ran

dla hemoglobiny przy A = 540 nm, a dla chromianu potasu przy A ■ 390 nm

Wykona) na papierze milimetrowym wykres zależności absortoanqi (os Y) od objętości etucyjne*

(oś X) dla trzech uzyskanych frakcji

Oblicz wartość współczynnika podziału (K*,) dla błękitu dekstranowego, hemogtotony i cnranvaru. potasu zgodnie z poniższą tabelą

Składnik	V»(mL)	V. (mL)	■ Yt -A .	K- V.-V«/V,-V0
Błękit dekstranowy
Hemoglobina
Chromian potasu

gdzie:

Vo ~ objętość rozpuszczalnika zalegającego między ziarenkami żelu, wyznaczana jako objętość elucji od chwili naniesienia próbki do momentu wypłynięcia substancji wysokocząateczkowet (błękitu dekstranowego) z kolumny

V. - objętość niezbędna do wyeluowanla danej substancji z kolumny, wyznaczana jako objętość elucji od chwili naniesienia próbki do momentu wyjścia z kolumny danego składnika mieszaniny V| - całkowita objętość kolumny (n r*h, gdzie r - promień kolumny, h- wysokość słupa żelu)

Uwaga: nie zapomnij zmierzyć średnicy kolumny I wysokości słupa żelu w używanej w doświadczaniu kolumnie