302

Tabela V-1.2. Metody selekcji mutantów

Typ mutanta	Metody selekcji
Mutanty opornościowe: oporne na inhibitory, antybiotyki i bakteriofagi	wysiew około 10^8 komórek na pożywkę z inhibitorem, mutanty opornościowe przeżywają i tworzą kolonie
Mutanty auksotroficzne: niezdolne do syntezy witamin, aminokwasów, kwasów nukleinowych lub innych składników budulcowych komórek	selekcja metodą penicylinową w celu zabicia komórek dzikich, wysiew pozostałych komórek na pożywkę zawierającą śladowe ilości związku, którego dane auksotrofy nie mogą syntetyzować, mutanty rosną w postaci mikrokolonii
Mutanty kataboliczne: defektywne w enzymatycznych szlakach katabolicznych	wzbogacenie frakcji mutantów metodą penicylinową, metoda selekcji bezpośredniej - stosuje się pożywki z dodatkiem indykatora (eozyna-blękit metylenowy, czerwień obojętna, fiolet krystaliczny) lub substratów chromogennych (np. X-Gal*), na których kolonie mutantów zmieniają barwę, metoda selekcji pośredniej - zdolność do wzrostu w postaci mikrokolonii
Mutanty temperaturozależne: mutanty temperaturooporne, tolerujące wysokie temperatury i mutanty temperaturowrażliwe o zwiększonej wrażliwości na wysoką temperaturę	wzbogacenie frakcji mutantów poprzez dobór temperatury hodowli pozwalającej na lepszy wzrost mutantów niż komórek nie zmienionych, możliwość zastosowania metody penicylinowej do wzbogacania frakcji mutantów
Mutanty regulatorowe: zmieniona szybkość wzbogacenie frakcji mutantów poprzez ciągłą hodowlę w warunkach syntezy jednego lub kilku enzymów ograniczania wzrostu małym stężeniem substratu, naprzemienny metabolicznych wzrost w pożywkach z dwoma substratami, selekcja w obecności antymetabolitów hamujących wzrost komórek nie zmienionych

* X-Gal: 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-0-D-galaktopiranozyd

mutanty lac⁺, jak i lac~. Jeżeli do pożywki dodamy mieszaninę eozyny i błękitu metylenowego, to wokół kolonii szczepów zdolnych do fermentacji laktozy powstanie fioletowa otoczka, tworząca się w wyniku wytrącenia eozyny i błękitu metylenowego, świadcząca o miejscowym obniżeniu pH. Otoczka taka nie będzie występowała wokół kolonii lac~.

Selekcja mutantów opornych na antybiotyki polega na posiewie komórek na pożywkę z dodatkiem określonej dawki antybiotyku, przy której giną komórki wrażliwe, a wyrosłe kolonie stanowią populacje powstałe z komórek mutantów opornych. W celu

Rys. V-1.2. Selekcja mutantów auksotroficznych metodą replik: 1,3- płytki z pożywką kompleksową, 2 - płytka z pożywką minimalną

302