biotechnologia2

ELEKTROFOREZA KWASÓW NUKLEINOWYCH

Elektroforeza - tachnika stosowana pny    . — Gzie i oczyuuaw lwów nukleinowych i białek.

DNA i RNA mąją ładunek tgomny i zgodnie z tym ładunkiem. nadawanym przez grapy fosforanowe . —grają w poła elektrycznym w kierunku anody. Szybkość migracji akty od wickold i knlałtn aąaeaki Schemat postępowania jest następujący : Del ulega zestaleniu w formie cienkiej płytki aa podstawce tzw. saneczkach wraz z zanurzonym specjalnego typu grzebieniem, który następnie wyciąga się.

W zastygłym żelu znąjduje się szereg dołków , do których wprowadzane są próbki DNA oraz z reguły tzw. standard czyli mieszanina cząsteczek o znanych masach dzięki czemu możliwa będzie później kalibracja żołn. Przed naniesieniem na żel próbki muszą być odpowiednio przygotowane : dodawany jest barwnik . który informuje nas później jak daleko zaszły najszybsze cząsteczki (co jest niezbędne ponieważ DNA w toto nie widać) oraz związek interkalujący - bromek etydyny , który fluoryząje w kwiecie UV co pozwoli nam na zlokalizowanie prążków.

Minimalna ilość DNA . którą widać na żelu w postaci prążka to 20 ng. Ilość DNA w prątku nie powinna przekraczać 200 ng ponieważ obserwtąje się przeładowanie kieszonki. Żel umieszczony zostaje w specjalnym aparacie do elektroforezy i zalewany buforem przewodzącym prąd. Podłączony zostaje do zasilacza generującego prąd o stałym i określonym napięciu i natężeniu. Jakość rozdziału fragmentów DNA zmniejsza się w miarę zwiększania napięcia w czasie elektroforezy. Dla otrzymania optymalnej jakości stosuje się napięcie nie większe niż 5V na lcvn długości toto.

Kalibracja wielkości fragmentów cząsteczek w żęto opiera się na zasadzie , to liniowe cząsteczki DNA migrują w toto garażowym z prędkością odwrotnie proporcjonalną do logarytmu dziesiętnego ich masy cząsteczkowej wyrażonej w Dałtonach łub w tysiącach par zasad czyli kb. Kalibracja toto polega na wykreślania krzyw^ zależności odległości przebytej w czasie elektroforezy przez poszczególne fragmenty od logarytmu masy cząsteczkowej.

Elektroforezę można przeprowadzać w żelach natywnych łub denaturujących.

1.    Żele agarozowe - dla dużych cząstek DNA

Metoda szybka , prosta . powszechnie stosowana. Zdolność rozdzielcza zależy od wielkości potów w żelu , których rozmiary są zdeterminowane przez stężenie agarozy. Żeli bardziej stężonych tj. 1,4-2,0 % używa się do rozdziału cząsteczek mniejszych (0,5*2,0 kb). Żele mniej stężone 0,5*0,7 % stosuje się do rozdziału cząflecak większych (10-20 kb i więcej).

2.    Żele akryłamidowe - dla małych cząstek DNA    _ ,

Powstają przez polimeryzacje monomerów akry lam idu w długie łańcuchy z wytworzeniem wiązań poprzecznych przez bisakrylamid. Można regulować sieciowanie poprzez manipulację proporcjami stężeń akry lam idu do bisakrybunldu. Do zajścia reakcji niezbędna jest obecność odpowiedniego kalali retora (PERS -nadsiarczan potasowy) i związku inicjującego reakcję (TEMED). Żele te stosuje się przy rozdziale fragmentów o wielkości od kilku par zasad (20% poHakrylamid) do tysiąca par zasad (3% poliakrylamid) a także przy rozdziale jednoniciowych cząsteczek DNA np. do sekwencjonowania.

Szybkość migracji DNA w iełu agarozowym zależy od:

-    masy cząsteczkowej DNA, czyli wielkości i kształtu

-    stężenia agarowy

-    konformacji DNA

-    natężenia poła ełektiyczn. (przy niższym migracja cząstek jest proporcjonalna do napięcia, wyższe natężenie me powoduje wzrostu prędkości migracji, dlatego max 5v/cm)

-    składu i siły jonowej bufoni / w buforach o niskiej sile jonowej DNA migruje wolniej, a zbyt szybki przepływ ładunku /np.: w buforze 10x/ powoduje wydzielanie ciepła /wzrost T, upłynnienie żelu i denaturację DNA/

Najczęściej stosowane bufory: TBE, TAE, zawierają EDTA i Tria oraz słaby kwas.

Do nanoszenia próbek DNA do studzienek służą odpowiednie bufory zwiększające gęstość /lepsze umiejscowienie próbek w studzienkach/, zabarwiające próbki /umożliwia śledzenie prawidłowości rozdziału.

Najczęściej stosowane bufory: błękitny /bromofenołowy z sacharozą/ - żel agarozowy, oraz „ficoł.” - roztwór błękitu bromofenolowego, ksylenu cyjanu i Fictillu w wodzie.